家蚕分子标记辅助育种相关基因研究进展

杨 尚 王佩仪 赵 鹏 袁 颖 吕颖贤 崔自学 黄永震 朱绪伟*

(1.河南省蚕业科学研究院，河南郑州 450000；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；3.河南省农学会，郑州 450000)

桑蚕(BombyxmoriL.)又称家蚕，属节肢动物门昆虫纲鳞翅目蚕蛾科蚕蛾属桑蚕种，是以桑叶为食料的泌丝昆虫。它起源于中国，对世界蚕丝业的发展和丝绸文明作出了巨大贡献。桑蚕是完全变态昆虫，生活周期短，一生经过卵、幼虫、蛹、成虫四个形态、生理机能完全不同的发育阶段。整个世代只有幼虫期摄食，并为之后的生命活动积贮营养。目前，我国拥有家蚕种质资源1 000多份，选用覆盖所有28个连锁群的100个SSR(Simple Sequence Repeat，SSR)标记构建了510个家蚕品种资源的指纹图谱，实现了从分子水平能够对各类家蚕品种进行鉴别，并可根据品种指纹图谱，分析品种间的分子遗传距离及亲缘关系。分子标记是用于遗传育种的重要工具，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接反映DNA水平遗传多态性。RFLP(restriction fragment length polymorphism)、RAPD(random amplification of polymorphic DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphisms)、SSR(simple sequence repeats)和SNP(single nucleotide polymorphism)等分子标记陆续被应用到家蚕遗传育种中[1]，这一系列分子标记和家蚕基因组学信息为家蚕遗传育种如何突破传统资源利用的极限提供了新的思路和靶标。利用转基因技术，部分靶标已经被成功应用至家蚕遗传育种工作中，在产量、质量、抗性等方面累积了大量的转基因素材，也开拓了生物反应器、害虫防控等新的应用领域。

1 家蚕分子标记辅助育种相关基因

1.1 生长发育方面

昆虫的生长发育过程受蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenile hormone，JH)的协同作用，20E具有促进细胞生长的作用，可刺激细胞分裂，可以使昆虫生长出新的表皮；JH是可保持昆虫幼虫性状和促进成虫卵巢发育的激素。Liu等[2]研究了20E在家蚕中的表达及其调控途径，发现20E通过在家蚕表皮不同区域的同源结构域蛋白POU-M2、antennapedia(Antp)和abdominal-B(Abd-B)正向调控Clip-domain serine protease 13(CLIP13)的转录，从而影响蜕皮过程。在转录水平上，CLIP13在表皮不同区域的表达具有明显的时空特异性，同源结构域转录因子POU-M2、Antp和Abd-B分别在头囊、胸部和腹部表现出与CLIP13相似的表达变化趋势。POU-M2、Antp和Abd-B通过直接与CLIP13启动子中的顺式反应元件结合参与了CLIP13的转录调控。RNA干扰介导的POU-M2、Antp和Abd-B沉默导致CLIP13在头包膜、第1至第3胸段表皮和第7至第10腹段表达下降。He等[3]发现前体microRNA-14(pre-miR-14)在家蚕中编码两个成熟的miRNA，Bmo-miR-14-5p和Bmo-miR-14-3p，都调控着20E信号通路中的各种基因，他们在蜕皮后立即增加，有效地抑制了20E的生物合成、上游调控和下游应答基因。且Bmo-miR-14-5p比Bmo-miR-14-3p具有更强的发育调控作用。Qian等[4]研究发现PKA介导的磷酸化作用通过干扰家蚕BR-C与DNA的结合抑制其活性，而20E信号通路可缓解PKA介导的BR-C磷酸化，从而维持其转录活性。

Yokoyama等[5]对家蚕Kosetsu品系和日本野桑蚕种群的滞育诱导层次分子机制进行了比较分析，表明母本胚胎发育过程中的温度信号主要通过热敏感瞬时受体电位锚蛋白1(thermosensitive transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1)和滞育激素(diapause hormone，DH)信号通路影响滞育决定。尽管家蚕的DH信号通路和TRPA1的热敏感性都是保守的，但其胚胎滞育是依赖于光周期的。由此他们推测TRPA1激活的信号与Kosetsu中参与滞育诱导的信号通路密切相关，因为TRPA1敲除突变体中温度依赖的诱导被光周期诱导所取代，从而选择性地利用温度信息作为诱导信号。

在家蚕生育能力方面， Fujii等[6]利用家蚕和野桑蚕之间的体色多态性差异，发现Bm-cN-Ⅱ基因决定了家蚕p-oily突变体表型，其功能是将肌苷酸转化为肌苷，可能与家蚕雄蛾生育能力的遗传有关。Kasahara等[7]对家蚕的dmrt11E基因(Bombyxdmrt11E，Bmdmrt11E)进行了功能分析，发现该基因在幼虫最后龄期的子房中优先表达，成虫期其mRNA在卵细胞中积累。当用CRISPR/ Cas9介导敲除Bmrt11E导致卵子发生缺陷，会产生透明液体的异常卵子，这些卵子的生育能力和血脂水平显著降低。通过对照和突变体昆虫在两个发育阶段的卵巢转录组比较，发现了6个可能受Bmdmrt11E控制的基因。Wang等[8]发现了由家蚕组蛋白赖氨酸n -甲基转移酶无卵基因(Bombyxmorihiston-lysineN-methyltransferaseeggless，BmEgg)第9 -13外显子环化的 circEgg主要分布在细胞质中，其表达量随家蚕发育阶段的变化而变化。circEgg过表达时BmEgg基因的线性转录水平降低。circEgg通过海绵吸收bmo-miR-3391-5p，编码circEgg- p122蛋白，调控组蛋白修饰。

在家蚕胚胎发育过程中， Liu等[9]研究发现使用GAL4/UAS系统过表达miR-14转基因会导致家蚕幼虫发育迟缓，幼虫和蛹体型变小，20E效价降低。相反，使用转基因CRISPR/Cas9系统破坏miR-14会导致早熟游走期，且20E滴度增加。

在丝腺发育相关基因层面上的改良可以帮助人们获得更高品质的蚕丝，Hou等[10]经染色质免疫沉淀和测序，确定了Dfd(TheBombyxmoriDeformed)为Sage的下游靶基因，并证实Sage可以通过与SGF1竞争抑制Dfd的表达。通过RNA干扰(RNAi)敲除Dfd后，中间丝腺细胞数量减少，后丝腺变直，同时，Sericin1(Ser1)和丝素蛋白基因的不再是严格的区域性表达。这些变化最终导致了Dfd RNAi茧组成的改变。Kajiura等[11]以昆虫的N-糖基化为重点，鉴定了参与哺乳动物复杂N-聚糖生物合成的家蚕N-乙酰半乳糖氨基转移酶(Bombyx mori N- acetylgaltosaminyltransferase，BmGalNAcT)，BmGalNAcT定位于高尔基体，广泛表达于各器官和5龄幼虫中丝腺发育阶段。同时他们证实了BmGalNAcT将GalNAc转移到GlcNAcbeta1，2-R的非还原末端，具有beta1，4-连锁。他们也发现BmGalNAcT介导半乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖残基的转移，但不介导葡萄糖或葡萄糖醛酸从UDP-糖供体底物向N-聚糖的转移。他们证明了家蚕具有一种新型的多功能糖基转移酶，但其N-糖基化受到内源性N-糖基化机制的严格调控。Ruan等[12]采用高通量RNA-seq技术，研究了秋凤、白玉、Nd-s(D)和Nd蚕5龄第3天后丝腺中lncRNA和mRNA的表达谱。发现26 767个新lncRNAs和6 009个新mRNA，秋凤与Nd-s(D)和秋凤与Nd相比，丝蛋白基因和丝腺转录因子的表达水平降低，而许多与自噬、凋亡、RNA降解、泛素介导的蛋白水解和热休克蛋白增多。故大量负责蛋白质合成和分泌的基因在Nd中表达显著减少。Luan等[13]利用正向遗传学方法在Z染色体主效QTL中确定了控制蚕丝产量的基因，使用极端表型的亚种并选择了高产菌株872B和低当量应变IS-Dazao作为亲本的回交群体BC1 M，Z染色体上的基因候选映射区域缩小至134 kb的染色体。通过时空表达分析发现，该区域的BmAbl1与丝腺发育相关，在高产株系和低产株系的后丝腺中差异表达。在BmAbl1中，在84头不同产量的家蚕中检测到一个位于第10外显子区域的插入-缺失(indel)和位于第6内含子区域的SNP与茧壳重量有关。

Yin等[14]分析了BombyxmandarinaScalloped(BmSd)在家蚕翅发育过程中的作用，该基因被认为是海马通路相关基因之一，发现BmSd在家蚕翅膀发育过程中起着至关重要的作用。在u11中，BmSd表达量在游走期逐渐减少，而在p50中表达量则相反。当小siRNA在p50菌株游走期敲除BmSd时，57.9%的个体表现出小翅。此外，ex、kibra和无翅表达水平在BmSd敲除突变体中降低。聚类规律间隔短回文重复序列(CRISPR) / CRISPR相关蛋白9介导的BmSd缺失诱导了50%的小翅个体，表明Hippo信号通路参与并在家蚕翅发育调控中发挥重要作用。Uno等[15]研究发现RabX6参与了家蚕大脑中睾丸生长和雄性特异性神经肽分泌的调节。

Yang等[16]利用RNA测序(RNA-seq)对l-4i突变体及其野生型菌株P33研究发现，2 013个基因显著下调，其中剪接体snRNP组装、蛋白折叠和蛋白分解代谢等20个生物学过程在这些下调基因中显著富集。在l-4i突变体中，2 405个基因显著上调，其中嘌呤碱基代谢过程、核苷代谢过程和重新合成过程等20个生物过程显著富集。表明多种生物学过程和通路的不平衡以及RNA选择性剪接产生的异常蛋白质可能导致l-4i突变体的死亡。

1.2 免疫方面

Shen等[17]从家蚕中克隆了CTL基因CTL-S6的全长cDNA。moriCTL-S6的开放阅读框(ORF)编码378个氨基酸，其中包含一个分泌信号肽。CTL-S6 mRNA在中肠的转录水平最高，在大肠杆菌或黄体微球菌感染下，其在脂肪体和血细胞中的转录水平显著升高。纯化的重组CTL-S6能与细菌细胞壁成分结合，包括枯草芽孢杆菌的肽聚糖(PGN)和脂多糖，重组CTL-S6参与了血细胞的包封和黑化。此外，在家蚕的血淋巴中加入重组CTL-S6能显著提高酚氧化酶活性。表明moriCTL-S6可能作为一种识别外源病原菌、刺激酚氧化酶原通路和参与先天免疫的模式识别受体。Yin等[18]表明circRNA可能参与桑蚕脂肪体的免疫应答。利用高通量RNA测序分析了在桑蚕脂肪体中差异表达(differentially expressed，DE)环状RNA、microRNAs(miRNAs)和mRNA对Bombyx mori nucleopolyhedrosis virus(BmNPV)感染的反应。共鉴定出77个与BmNPV感染相关的DEcircRNAs、32个DEmiRNAs和730个DEmRNAs。构建了DEcircRNA / DEmiRNA / DEmRNA和DEcircRNA / DEmiRNA / BmNPV基因调控网络，并验证了circ_0001432及其对应的miRNA (miR-2774c和miR-34065p)和mRNA(778467和101745232)在网络中的差异表达，检测了circ_0001432的组织特异性表达及其在不同时间点的表达情况。通过对DEmRNAs、DEmiRNAs靶基因以及网络中DEcircRNAs宿主基因的KEGG通路分析，发现这些基因在多种代谢通路和信号通路中富集，在昆虫免疫应答中发挥重要作用。

1.3 性别决定方面

在家蚕中，雌性是由W染色体上的显性雌性化因子决定的。家蚕双性基因(Bombyxmoridoublesex，Bmdsx)是果蝇双性基因的同源基因，是性别决定级联反应的最底层基因。从家蚕中分离到具有性别特异性的调控基因Sxl同源物。在家蚕基因组中还没有发现跨同源物。尽管存在这些差异，但家蚕的dsx同源物(Bmdsx)与性别决定有关。Bmdsx产生选择性剪接的mRNA亚型，编码在dsx中观察到的性别特异性转录因子。Sakai等[19]对家蚕性别决定级联的双开关基因Bmdsx和BmIMP的表达模式进行了研究。发现逆转录PCR (RT-PCR)分析显示雄性Bmdsx在雌虫产卵后27和29 h表达，最终在32 h消失。此外，BmIMPmRNA在这些雌性中也有表达，其表达水平与雄性型Bmdsx mRNA相当，说明家蚕性别决定的主开关基因在这一时期在雌性中表达，抑制了性别决定基因的雄性特异性表达模式。

从性别基因层面上的改良可以帮助人们更好实现选育， Xu等[20]研究了雄性特异性基因修饰系统，认为BmR1p或Bmbeta4p这两个启动子可能作为调控睾丸特异性基因表达的不同调控因子，可帮助更好地了解昆虫睾丸特异性基因的功能。

Nakata等[21]研究了家蚕Bmdsx在大脑发育过程中的表达，发现在大脑中Bmdsx以性别和发育阶段依赖的方式差异表达，Bmdsx在性二态神经回路的发育中发挥作用，但神经回路与蚕蛾的性行为无关。BmDSX蛋白表达细胞位于蛹和成虫大脑的背内侧区，在雄性和雌性中分别构成两个和一个神经簇。bmdsx阳性细胞的数量在蛹期早期至中期达到高峰，表明在这一时期两性神经回路已经建立。Bmdsx在体细胞性发育中起着至关重要的作用，它的pre-mRNA性别特异性剪接产生两个剪接变体：一种编码雌性特异性多肽，另一种编码雄性特异性多肽，它们只在c端不同。Bmdsx的开放阅读框由5个外显子组成，其中外显子3和4是雌性特异性的，在雄性中被跳过。

Xu等[22]发现雄性蚕蛾的求偶和交配行为是通过突变属于两个保守途径的性别决定级联基因来调控的。Bmdsx基因表达的缺失通过降低BmOR1基因产物的表达，显著降低了对主要信息素组分bombykol的外周感知，而BmOR1基因的产物完全阻碍了成年雄性的求偶。并且他们发现交配行为是由另一个性别分化基因Bmfru独立调控的，Bmfru的丧失完全阻碍了交配，但雄性表现出正常的求偶行为，Bmfru表达的缺失由于下调了BmOR3的表达，显著降低了对次要信息素组分bombykal的感知。进一步发现BmOR3产物的丢失在终止雄性交配行为中起着关键作用。Liu等[23]在HEK293T细胞中使用双荧光素酶报告基因检测，证实了miR-2738抑制BmPSI、Bmdsx和BmMasc的转录。使用CRISPR/Cas9转基因系统的miR-2738的遗传中断增加了BmPSI和BmMasc转录本的水平，而Bmdsx的剪接未受miR-2738缺失或过表达的影响。表明miR-2738是家蚕性别决定基因的一个次要调控因子。

piRNA是家蚕W染色体衍生的、雌性特异性的雌性化因子。家蚕的piRNA生物发生机制比果蝇的更简单，因为家蚕没有依赖相型piRNA的转录沉默机制。Kiuchi等[24]研究发现了一个piRNA是由Fem的piRNA前体产生的。Fem序列串联排列在W染色体的性别决定区。雌性胚胎中雌性衍生的piRNA介导的信号传导抑制导致了雄性特异性剪接变异的家蚕双性(Bmdsx)，该基因在性别分化级联的下游末端起作用。在家蚕Z染色体上发现了一个Fem源piRNA的靶基因，命名为Masc，它编码一种ccch型锌指蛋白。并发现Fem piRNA沉默Masc信使RNA是在雌性胚胎中产生Bmdsx雌性特异性亚型的必要条件，而且Masc蛋白控制着雄性胚胎中的剂量补偿和雄性化。Katsuma等[25]分别对siRNA和piRNA通路的核心因子Ago2和Siwi进行了CRISPR/ Cas9介导的基因组编辑，发现在Ago2和Siwi突变的细胞中，大约有一半的等位基因包含功能缺失突变，与对照细胞相比，突变细胞的生长速度较慢。Siwi突变的细胞中piRNAs的数量显著减少，但没有观察到转座因子整体去抑制。虽然潜伏感染的BmLV的RNA量在Ago2和Siwi突变的细胞中均增加，但siRNA和piRNA通路分别倾向于靶向BmLV基因组和亚基因组RNA。Nishida等[26]研究发现，在家蚕中Zucchini(Zuc)内切酶缺失对3'- 5'外切酶修剪器(Trim)和Nibbler3’-5’外切酶(Nbr)水平没有影响，但导致了Papi复合物中piRNA中间体的异常积累，并通过重组Zuc处理这些中间体形成成熟的piRNA。Papi仅在与PIWI结合并磷酸化时才发挥其RNA结合活性。还证明了家蚕piRNA的5'端是由PIWI切片机活性形成的，但独立于Zuc，而3'端是由Zuc内切酶形成的。

1.4 抗病方面

在基因层面上的改良可以帮助人们获得抗病的蚕品种，BmNPV病毒的传染性和致病性强，是蚕业生产中最容易给蚕农带来经济损失的病原之一。从宿主家蚕入手， Jiang等[27]将BmNPV的ie-1、helicase、gp64和vp39分别构建了多个转基因RNAi载体，对转基因幼虫的抗BmNPV能力、病毒基因MRNA水平和BmNPV含量进行系统比较和分析。之后发现分别转入家蚕内源抗病毒基因Bmlipase-1[28]和外源hycu-ep32基因[29]，调控家蚕免疫通路的关键基因Bm Spry和Bm PGRP2[29]，都可以提高家蚕抗BmNPV病毒能力。Wu等[30]研究发现过表达bmo-miR-2819可以通过下调BmNPV IE-1基因的表达来抑制BmNPV复制，说明细胞miRNAs可以通过调节病毒基因的表达来影响病毒感染。Dong等[31]在家蚕细胞中建立了一个高效的BmNPV诱导ATAD3A-KO转基因家蚕系，提高了基因靶向性和抗病毒效率。

从病毒入手，Zhang等[32]研究BmNPV的ie-1和lef-1基因，构建载体制备出了抗性提高的转基因家蚕。Singh等[33]研究发现在BmNPV感染早期，bmnpv-miR-3可通过负向调控DNA 结合蛋白(P6.9)和其他晚期基因的表达来逃避宿主的早期免疫应答。另外，Chen等[34]利用转座子转化技术和 CRISPR/ Cas9系统，在家蚕体内直接裂解BmNPV基因组DNA，促进病毒清除，建立了一种新的抗病毒策略。家蚕细胞质多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)也是家蚕经济害虫家蚕的主要病原。Guo等[35]研究发现BmCPV-miR-1可以通过上调家蚕凋亡抑制蛋白(Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein，BmIAP)的表达来抑制被感染家蚕的细胞凋亡，为病毒的复制提供了更好的细胞环境。

Zhang等[36]认为家蚕蛋白酶抑制剂BmaSPI51活性位点的特定氨基酸序列以及C端形成的二硫键是其具有较高抗真菌活性的关键因素，突变导致了驯化过程中抗真菌活性发生了变化。

1.5 全基因组选择育种方面

Li等[37]对本地和基因改良的家蚕品系进行了全基因组选择性扫描分析，认为改良可能影响了蚕的神经系统。他们鉴定出24个具有强选择信号的基因组区域，其中8个区域包含13个候选基因，其中6个基因注释了与神经信号反应相关的功能。在这6个基因中，BGIBMGA004050编码家蚕CREB-regulated transcription coactivator 1 (BmCRTC1)，该基因参与了能量传感通路。简单重复序列 (simple sequences repeats，SSRs)是共显性表达，广泛分布于真核生物的基因组中，是优良的遗传标记，甘丽萍等[38]研究搜索到家蚕全基因组中SSRs序列为141 311个位点，总长度为2.41 Mb，全基因组SSRs六种碱基重复类型的数量和密度分布模式为：单碱基>四碱基>三碱基>二碱基>五碱基>六碱基，说明全基因组以单碱基为主要碱基类型，六种碱基类型中五碱基SSRs G-C含量最高。张正斌等[39]构建两个抗性品系的BC3M和BC4M分离群体，利用简化基因组测序技术2b-RAD(基于IIB型限制性内切酶的RAD)进行亲本和杂交分离群体的基因组测序，筛选位于染色体上与抗性相关的多态性SNP标记，进行抗性品种的基因型分析。获得抗性亲本AN、野BN的多态性SNP标记11 919个和12 293个，推测AN、野BN两个品系的Bm NPV高抗性与抗性主基因和其他抗性基因的联合作用有关。

2 展 望

家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，其丰富的研究价值还需进一步探索，众多基因的功能都可以在家蚕中体现，生长发育、性别决定、生物钟相关基因等都可以为昆虫的研究提供有效参考。家蚕是一种重要的经济昆虫，其产生的蚕丝是重要的纺织原料，以蚕丝贸易为代表开辟的丝绸之路，更是孕育了早期的东西方文明的交流与传播，因此关于家蚕的研究仍具有极大的经济价值、文化价值和现实意义。