原生质体融合技术在食用菌上应用研究进展

2021-11-27李亚娇孙国琴郭九峰王海燕于传宗

北方农业学报 2021年6期

李亚娇，孙国琴，郭九峰，王海燕，于传宗，庞杰

（1.内蒙古自治区农牧业科学院蔬菜花卉研究所，内蒙古呼和浩特 010031；2.内蒙古大学物理科学与技术学院，内蒙古呼和浩特 010021）

近年来，人们越来越关注健康饮食，养生已成为现代人追求的生活方式，食用菌不仅味道清鲜、营养丰富且具有药食同源的功效，其加工产品也已成为人们青睐的绿色、健康食品，深受国内外学者关注，因此，食用菌的资源及种质开发存在巨大的市场潜力[1-3]。目前，生物技术在食用菌领域应用方面已取得了很大进步，尤其是原生质体技术为食用菌菌种改良、新品种选育、野生种驯化的研究提供了一个十分重要的基础性方法[4-5]。与自然育种、杂交育种、诱变育种等相比，利用原生质体的生物学特性进行原生质体融合育种，具有优势[6-8]。脱掉细胞壁后的原生质体，解除了菌株间物理上、生理上的屏障，实现了种间、属间及科间远缘融合进行染色体交换、重组，最后经过再生培养筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子[9-11]，从而有目的地选育具有突出优良性状的新菌株和进行野生菌驯化，以满足生产需要、社会需求。尽管基因工程和基因编辑领域取得了长足的进展，但原生质体融合技术在生物育种和种质创新方面仍然具有不可替代的优势和地位，笔者就原生质体融合技术在食用菌育种方面取得的进展进行综述，以期为进一步挖掘其科研生产潜力提供指导。

1 原生质体的制备与再生

原生质体制备与再生易受选取材料和外界条件的影响，要想获得最佳的制备和再生条件，需要对各因素进行综合研究。

1.1 原生质体的制备

原生质体是指含有该物种的全部遗传物质，且在外力的作用下被脱掉细胞壁的细胞[12]。原生质体融合的第一步为原生质体制备，早期运用机械、超声等物理方法进行原生质体制备，效果欠佳。直到1972年DE VRIES 等[13]成功地利用酶解法分离得到裂褶菌原生质体，1981年食用菌脱壁酶问世，原生质体技术在食用菌上的应用才有了实质性进展[14-16]。食用菌属于丝状真菌，且不同种类的食用菌细胞壁成分存在差异，即原生质体制备条件因食用菌的种类不同而不同。酶解时间、酶解温度、稳渗剂种类及浓度、酶解pH 值、食用菌种类、菌龄、酶浓度等因素都影响活性原生质体的释放。李春霞等[17]通过单因素筛选试验，得到真姬菇原生质体的最佳酶解条件为酶解温度32 ℃、酶解时间3.5 h、渗稳剂0.6 mol/L甘露醇、溶壁酶浓度20 mg/mL，原生质体数量最大可达到6.75×106个/mL。春霞[18]以草原黑蘑hm8124-1（菌盖棕色）、草原蘑菇hm910（菌盖白色）两个菌株摇培8 d 的菌丝体为试验材料制备原生质体，当溶壁酶浓度为1.4%，25 ℃ 酶解4 h，可以制备足够的原生质体。王金斌等[19]以褐色双孢蘑菇棕秀一号为试验材料，利用Design-Expert 软件进行二次回归分析，对褐色双孢蘑菇制备原生质体的条件进行优化，结果表明，原生质体最佳制备条件为1.35%溶壁酶+7.01%蜗牛酶、酶解温度30.4 ℃、菌丝体菌龄8.36 d、酶解时间3 h，在此条件下原生质体产量高达4.39×107个/mL。娄海伟等[20]探究蛹虫草单核芽生孢子的原生质体制备条件，响应面优化试验结果表明，蛹虫草原生质体最适制备条件为溶壁酶质量分数2.06%、酶解温度26.1 ℃、酶解时间2.57 h，在此条件下，原生质体得率的预测值为8.97×106个/mL，验证试验所得原生质体得率为（9.17±0.29）×106个/mL，预测值和试验值差异不显著，回归模型拟合良好。宋天磊[21]对桑黄原生质体制备条件进行初步探索，发现桑黄菌丝体细胞壁在溶壁酶浓度为2%，25～30 ℃条件下酶解3 h 可达到较好的脱掉细胞壁效果，且原生质体的产量与菌龄没有明显的线性关系。

1.2 原生质体的再生

原生质体再生是指生物体（微生物或植物）细胞由原生质体重新形成细胞壁，直至形成菌或植株的过程，食用菌原生质体的再生率受再生培养基成分、pH 值、渗透压稳定剂的容量和种类等因素影响。冯婷婷等[22]采取单因素试验和响应面法对影响蟹味菇原生质体再生条件的主要因素：菌龄、渗透压稳定剂种类、溶壁酶浓度和酶解时间进行筛选与优化，单因素试验表明，原生质体最佳再生条件为菌龄6 d，渗透压稳定剂为0.6 mol/L 甘露醇，溶壁酶浓度为2%，酶解3 h；响应面法表明，0.6 mol/L 甘露醇为渗透压稳定剂时，最佳再生条件为菌龄7 d，溶壁酶浓度为2%，酶解4 h。白静莹等[23]分析不同葡萄糖浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL 及不同pH 值分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 对暴马丁香桑黄原生质体再生率的影响，结果表明，当其他试验条件一定，葡萄糖浓度为30 mg/mL 时，原生质体再生率最高，为23.67%；当其他试验条件一定，pH 值为7 时，原生质体再生率最高，为19.33%。邹彰毅等[24]以姬松茸JS01 为试验材料，对姬松茸原生质体的再生条件进行优化，结果表明，菌龄6 d，以0.6 mol/L MgSO4作渗透压稳定剂，溶壁酶浓度2.0%，酶解温度30 ℃，酶解时间3 h，pH 值6.5，再生培养基为GM 时，原生质体的再生率最高，为1.12%。再生培养基中添加纤维二糖和VB1后，再生率为1.17%，较优化结果提高了4.46%；首次通过在再生培养基中添加细胞壁前体物质及营养因子，进一步提高姬松茸原生质体的再生率。崔晓等[25]采用正交试验法探究影响秀珍菇原生质体制备和再生的条件，对菌龄等7 个单因素、4 个复合因素条件和接种方式进行系统研究，结果表明，秀珍菇菌丝在改良液体PD 培养基中摇瓶培养5 d，以0.6 mol/L 甘露醇为渗透压稳定剂，2.5%溶壁酶在30 ℃条件下水浴4 h，得到的原生质体浓度最大，为4.23×107个/mL；在TB3 再生培养基中采用单层混菌法接种原生质体，再生率最大，为2.35%。

2 原生质体融合

1965年，Strunk 第1 次在采绒革盖菌中制备出原生质体，同时观察到自发性融合现象，以此为开端，原生质体融合技术受到国内外学者广泛关注并迅速发展[26-28]。原生质体融合技术在食用菌育种的应用上发挥着举足轻重的作用，跨种、跨属、跨科的融合也取得进展。原生质体融合有自发融合和诱导融合两种情况，前者融合比较困难，融合率极低，无法应用于试验研究；后者则需要通过人为干预融合，融合率显著高于自发融合，诱导融合主要有生物融合法、化学融合法和物理融合法。

2.1 生物融合法

早在20 世纪60年代，生物学家发现一些紫外线灭活的病毒膜片能使细胞间产生凝聚和融合，如仙台病毒1653 曾主要应用于细胞工程中的细胞融合技术，在病毒的外壳作用下直接产生这种细胞膜的融合，但此方法存在一定的不安全性、融合率低、操作较复杂，目前只在动物细胞融合中使用，未在食用菌原生质体融合领域采用[29-30]。

2.2 化学融合法

化学融合法始于20 世纪70年代，是比较常用的融合方法，原理是利用某种化学物质作用于原生质体，改变其细胞膜电位，发生细胞聚集，细胞膜结构发生变化，促使细胞膜融合，从而提高融合率[31]。常用的促融剂有聚乙二醇（PEG）、蟹合剂和二甲亚砜等，聚乙二醇促融剂最为常用。聚乙二醇法不仅对仪器设备要求不高，而且操作简单、方便，但也存在缺点，聚乙二醇作为促融剂不好把握原生质体聚集成团的程度，还会对原生质体产生一定毒性，这样原生质体容易受到损伤或损失，从而影响原生质体的再生率和融合率[32]。

化学融合法在食用菌原生质体融合技术中应用广泛。陈小红等[33]以茯苓和灵芝为亲本菌株，探究出其原生质体融合的最佳条件为25%PEG4000、pH 值8.5、在35 ℃下融合20 min，获得了可使RB-PDA平板稳定变色的融合菌株，通过分子鉴定其主要具有茯苓的遗传性状，与灵芝的亲缘关系较远，但具备部分灵芝的遗传性状。王波[34]以白色金针菇菌株3W4 和白色金针菇菌株FMY1203 为亲本，将双亲原生质体分别进行热灭活（60 ℃，3 min）和化学灭活（2%EMS）处理后等量混合离心，加入融合剂（40%PEG，0.05 mol/L CaCl2）进行融合处理，获得84 个再生菌株，且与亲本具有拮抗；ISSR 分子标记分析表明，融合子与亲本存在明显差异。李丽君[35]选用黑色羊肚菌菌株M10（四川省农业科学院选育的梯棱羊肚菌川羊肚菌1 号）和M20（山东农业大学保存出菇品质良好、产量较高的六妹羊肚菌）作为原生质体融合的亲本，在30 ℃水浴中以30%的PEG-CaCl2为助溶剂融合20 min，获得6 株生长势较好的羊肚菌菌株，将其与亲本进行菌丝生长速度比较与出菇试验，选育出2 株高产菌株R5 和R8。

2.3 物理融合法

物理融合法稍晚于化学融合法，于20 世纪80年代前后出现，具有可控制融合条件、无毒害、操作简单易行、融合效率高且融合子成活率高等优点，但对设备条件要求高且费用较贵[30]。最为常用的物理融合法是电融合法和激光诱导融合法，激光诱导融合法因为技术难度比较大，目前还在研究。

电融合法基本原理是原生质体在电场作用下，原生质体细胞紧密接触，通过瞬时电压击穿细胞膜出现可逆性孔洞，短时间内即可恢复，从而引起原生质体膜的融合，使原生质体在短时间内发生融合[36-38]。任轩等[39]以杏鲍菇和平菇为亲本菌株，两菌株按1∶1混合，运用电场诱导使其电融合，1 MHz、250 V/cm的成串脉冲电压，5.5 kV/cm 的融合脉冲电压时，杏鲍菇和平菇原生质体成对率达到70%，融合率为3.2×10-3。燕晓翠[40]利用电场诱导糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体融合，当交变电压和交变频率分别为30 V、1 100 kHz，脉冲场强、脉冲个数、脉冲间隔分别为6 kV/cm、4 个、10 μS 时，融合率为4.396×10-5，筛选出的3 株疑似融合株皆为亲本原生质体融合的产物。

3 融合子的鉴定

如何鉴定原生质体融合子关系到整个融合是否成功，因为融合体中可能会存在亲本、异核体、部分结合子、杂合二倍体、杂合系和融合子等，它们都会再生形成菌落，互相影响，从而抑制具有优良性状的融合子生长，所以如何鉴定并及时分离融合子，是原生质体融合成功的关键，尤为重要。鉴定融合子的常用方法有生物法和分子标记法。

3.1 生物法

3.1.1 菌落形态法菌落形态法是对融合菌株进行形态学观察，根据菌丝及菌落形态特征、生长速度、孢子形态等比对融合子再生菌落与亲本菌落的差异性，并进行下一步筛选[26]。

3.1.2 细胞学形态法原生质体融合子在萌发初期菌丝体核分布不同于亲本，融合子再生菌丝细胞核分布非常混乱，可以根据这一特点鉴定融合子。具体方法为通过凹玻片微培养，然后用吉姆萨（Giemas）结合苏木精进行染色，最后镜检，观察比对菌丝顶端生长情况及分枝、核相和锁状联合[30]。

3.1.3 拮抗实验法由于拮抗实验法具有直观、操作简单的特点，一般应用较多，拮抗实验具体方法是将两个亲本菌株与融合子菌株有间隔地接到同一培养皿上，融合子重组了双亲的遗传物质，则有了新的遗传特性，当菌丝长到交汇处时，如果与双亲都不亲和就会出现拮抗线，且越明显说明它们遗传差异越大，若菌丝体无分界线则为同一菌株[41]。

3.1.4 出菇试验法通过让融合子和亲本出菇，可以直接观察融合子的形态特征，由于融合子为杂种异核体，在适宜的条件下，有可能会形成子实体，其性状会介于两亲本，因此，可以从子实体的形态、色泽等特征上进行筛选[28]。

若要鉴定融合子融合是否成功大多采用菌落形态、细胞学、拮抗实验、出菇试验等方法相互结合、相互印证。康林芝等[42]探究金针菇与平菇远缘亲本原生质体融合，通过菌丝形态、细胞学观察，拮抗实验、出菇试验验证融合再生菌株，从18 个再生菌株中选择出1 株耐34 ℃高温金针菇菌株，且融合菌株为子实体粗壮、原基形成较多、菇形好的金针菇新品种，命名为F1P8。孙艳颖等[43]采用原生质体制备与再生筛选单核菌丝，进行香菇L808 和A288 杂交育种研究，初筛获得15 个杂交菌株。利用酯酶同工酶技术复筛，获得香菇原生质体杂交子10 个，然后进行出菇试验，结果表明，7 个杂交子正常出菇，2S-21、2S-28出菇早、产量高；2S-24 出菇虽晚但菇盖圆正，菇柄短粗、单生，商品性状好。2S-21、2S-24 和2S-28 的生物学效率达到82.70%、61.64%和88.82%，明显高于亲本香菇L808 和A288 的生物学效率（46.23%和50.78%）。孙艳颖[44]又以滑子菇早丰112 和滑子菇C3 为亲本进行原生质体的融合，得到的滑子菇原生质体融合子再生后，经过初步筛选有18 个菌株和双亲具有拮抗现象，说明融合子与滑子菇亲本在遗传性状上具有差异。根据酯酶同工酶复筛结果，获得14 个融合子，进行出菇试验，有10 个融合子成功出菇，其中有3 个出菇性状较好的菌株。

3.2 分子标记法

分子标记，又称DNA 标记，是生物遗传标记的一种，指可遗传并可以检测以及能用来作为指纹区分鉴定个体特征的DNA 片段，能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征DNA 片段，直接反映基因组中DNA 间的差异[27]。食用菌原生质体融合子的分子鉴定主要采用ISSR 标记技术和RAPD 标记技术。

3.2.1 ISSR 标记技术简单序列间重复序列（ISSR）是一种在PCR 基础上发展起来的新型分子标记技术，具有快速、高效、耗资少、模板DNA 用量少、遗传多态性高、重复性好等优点，是鉴定和确定品种遗传多样性的理想方法[45]。孙晓瑞[5]采用ISSR分子标记对秀珍菇和榆黄蘑原生质体融合情况进行遗传验证，证实融合子含有双亲遗传物质。郑锦荣[46]探究金针菇和巨大口蘑原生质体融合育种，对获得的3 株融合菌株R13、R14、R15 利用ISSR 技术进行遗传系数和聚类分析来鉴定融合株，结果表明，3 株融合菌株与巨大口蘑遗传相似系数均为0.49，与金针菇的遗传相似系数均为0.45。可以初步判断R13、R14、R15 均为新菌株，与双亲亲缘关系不明显。蔡佺佑[47]将秀珍菇与巨大口蘑的原生质体进行融合，应用形态学特征观察比较，筛选获得2 株融合菌株：R7-1 和R7-2，且菌丝生长速度快，与亲本形成较为明显的拮抗线，采用ISSR 技术对R7-1 和R7-2 两株融合菌株进行鉴定，初步说明R7-1 和R7-2 均为新菌株。

3.2.2 RAPD 标记技术 RAPD 即随机多态性DNA技术，是由美国科学家WILLIAMS 等[48]和WEISH 等[49]于1990年和1991年分别研究提出的一种新型DNA分子标记技术，又称为任意引物PCR。随机多态性DNA 技术，是以PCR 为基础，以一个随机寡核苷酸序列为引物（约10 个碱基），以试验材料基因组DNA 为模板，进行PCR 反应，找出扩增段的多态性。该技术应用广泛，无需专门设计RAPD 扩增反应引物，引物具有通用性，成本低，DNA 样品用量少且纯度要求不高，该技术简单易行、省时省力。杨珊[6]以猴头菌株0605 和猴头菌刺长为试验材料进行原生质体融合，第一轮挑选出67 株生长速度较快的融合再生菌株，第二轮采用SSCP 和RAPD 法进行鉴定，筛选出14 株融合菌株，分析14 株融合菌株生物学性状，可知R17 的菌丝体多糖含量比亲本0605 提高了7.43%；R51 和R53 的菌丝体生长速度最快，比亲本菌株0605 提高了24.48%。王珂[50]利用双灭活融合技术，将梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生质体融合，采用RAPD 标记对亲本及融合子进行鉴定，并进行聚类分析，结果表明，双亲本与融合子分为3 大类群：第一类群包括亲本梯棱羊肚菌（P1），第二类群包括所有融合子，第三类群包括亲本六妹羊肚菌（P2），从聚类分析可得出结论为真正的融合子。

4 存在的问题与展望

4.1 存在的问题

原生质体的制备及再生是原生质体融合技术的前提与基础，不同种类的食用菌制备条件各不相同，因此，不同种类的食用菌必须严格筛选、制备和再生的条件。食用菌原生质体融合可通过生物、化学、物理等方法，但生物融合法存在一定的不安全性、融合率低、操作较复杂，未在食用菌原生质体融合领域应用[29-30]；化学融合法中聚乙二醇作为促融剂不好把握原生质体聚集成团的程度，还会对原生质体产生一定毒性，从而影响原生质体的再生率和融合率[32]；物理融合法具有可控制融合条件、无毒害、操作简单易行、融合效率高且融合子成活率高等优点[27]，应大力推广安全、无毒、易操作的物理融合法。目前虽然有多达上百种食用菌原生质体制备与再生方法的报道，但能融合形成稳定融合子的种类并不多，能投入实际生产的少之又少。