寻常型银屑病患者miR-124与Th17 Treg细胞及相关细胞因子表达的关系

朴莉玲

深圳市龙岗中心医院，广东 深圳 518116

寻常型银屑病(psoriasis vulgaris)作为一种常见的慢性炎症性皮肤疾病，主要是因为皮肤受到损伤部位炎症细胞发生浸润以及毛细血管出现扩张而引发的表皮过度增殖[1-2]。临床研究发现，该病发病机制主要是因为CD4+T淋巴细胞免疫功能出现异常，活化的T细胞亚群在疾病的发生与发展中发挥了关键性作用[3]，其中Th17细胞在体内能够介导炎症反应的发生[4]，Treg细胞在体内则能够介导免疫抑制反应的发生，二者失衡会引发损害机体反应的发生[5]。Th17细胞通过诱导皮肤局部炎性反应的方式，破坏皮肤组织，寻常型银屑病发病时Treg和Th17的平衡性均出现异常，而治疗后则恢复到健康者的水平[6]，证实Treg和Th17的水平改变与寻常型银屑病有一定的相关性[7-8]。microRNA是一类新发现的内源性短链非编码RNA分子。目前有关寻常型银屑病患者体内miRNA的相关研究仍然处于基因表达以及特征基因库的初始建立阶段，对于miR-124在该类患者体内发挥的功能以及基因靶点治疗也未见深入性研究。大量研究均表明miR-124参与表皮细胞的生长分化以及凋亡等重要过程，但对其在疾病中的特异性表达和发挥机制仍不明确[9-10]。miR-124在寻常型银屑病患者中可能存在差异表达，抑制促炎性细胞因子TNF-α的表达，在寻常型银屑病的发展中发挥着重要作用[11]。为进一步研究miR-124与寻常型银屑病的关系，本研究选取100例寻常型银屑病患者，分析miR-124表达与Th17和Treg细胞及相关细胞因子表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年5月—2020年10月于深圳市龙岗中心医院治疗的寻常型银屑病斑块型患者100例，其中男58例，女42例;年龄18～35岁，平均(25.24±6.18)岁;进行期47例，稳定期53例。纳入标准：①符合《临床皮肤病学》寻常型银屑病的诊断标准[12]，且经组织病理学检查证实；②1个月内未服用过任何免疫抑制剂或皮质类固醇激素；③均已签署知情同意书。排除标准：①近期急性感染者；②合并严重的心、肝、肾等器官功能衰竭者；③妊娠及哺乳期患者；④不能配合完成本次试验者。同时选择同期在我院体检健康者50例作为对照组，其中男29例，女21例，年龄18～35岁。银屑病进行期组、稳定期组、对照组3组一般资料(表1)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究已通过医院伦理委员会审批。

表1 三组受试者一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及设备 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-21(IL-21)和白细胞介素-23(IL-23)因子ELISA试剂盒(上海碧云天公司)；孤儿受体转录因子(related orphan receptor，RORγt mRNA)和叉头状转录因子(fork head transcription factor，Foxp3 mRNA)引物(上海生工生物工程股份有限公司)。超低温冰箱(上海锦玟公司)、Thermo Fisher 高速冷冻离心机(美国赛默飞公司)、Tanon GIS 2010凝胶图像分析仪(上海天能科技有限公司)、BD公司FACSVia流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2.2 采集外周血样本 清晨抽取所有受试者空腹状态下2 mL静脉血于抗凝管中，4 ℃ 2 500 r/min离心处理10 min，取上清液贮存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2.3 PCR法检测各组miR-124表达水平 所取血液中加入1×红细胞裂解液，涡旋振荡2～5 s打散细胞沉淀，加入乙醇和缓冲液等提取DNA；设计和合成引物进行PCR体外扩增；制备琼脂糖凝胶，采用Tanon GIS 2010凝胶图像分析PCR反应产物；最后，通过PCR-RFLP及电泳分析检测miR-124的表达水平。

1.2.4 流式细胞仪检测Th17和Treg细胞数量 收集血液样本进行裂解，细胞悬液300 g离心5 min，弃掉上清，用细胞染色缓冲液重复洗1～2次，清洗、过滤，待上机检测。将外周血单个核细胞进行分离，通过磷酸盐缓冲液将细胞密度调整为5×106/100 μL，取调整后的细胞悬液100 μL，分别按照顺序依次加入CD3、CD4-FITC、CD4和CD25-PE单克隆抗体、同型对照抗体、IL-17、Foxp3、Foxp3-PE-Cy5和同型对照抗体，避光于室温下孵育1 h，4 ℃ 3 500 r/min离心10 min，分别加入破膜液和生理盐水洗涤2次，离心处理弃去上清液，流式细胞仪检测Th17和Treg细胞水平[7]。

1.2.5 ELISA法检测各组细胞因子水平 取血清标本采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-21和IL-23因子水平，操作按试剂盒说明书进行。

1.2.6 采用RT-PCR法检测各组ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA转录水平 采用Trizol法提取外周血RNA后，设计合成蛋白引物,采用RT-PCR法检测RORγt mRNA和Foxp3 mRNA的表达情况。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 20.0统计分析软件进行处理。3组间miR-124表达水平、Th17和Treg细胞水平、细胞因子水平、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA检测结果的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，采用Logistic回归法分析miR-124与Th17 Treg水平及与细胞因子表达的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组间miR-124表达水平比较

对照组miR-124的表达水平为1.84±0.12，银屑病进行期组为0.65±0.14，稳定期组为0.67±0.12。银屑病进行期组和稳定期组均低于对照组，差异有统计学意义(t分别为45.03、47.99，均P<0.05)。

2.2 各组间Th17和Treg细胞结果比较

经统计分析，三组间Th17、Treg水平和Th17/Treg比值存在统计学差异(图1，表2)。进一步分析发现，对照组Th17、Treg水平和Th17/Treg比值均明显低于银屑病进行期组和稳定期组，差异具有统计学意义(均P<0.05)；同时进行期寻常型银屑病患者Th17/Treg比值高于稳定期，而Treg细胞比例低于稳定期，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。

图1 三组间Th17和Treg细胞流式细胞仪检测结果

表2 各组间Th17和Treg细胞结果比较

2.3 各组间细胞因子水平比较

经比较，三组间各细胞因子水平存在统计学差异(表3)。进一步分析发现，寻常型银屑病进行期和稳定期患者TGF-β的浓度低于对照组，而其他细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-21和IL-23浓度均高于对照组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。进行期银屑病患者TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-21和IL-23水平与稳定期比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表3 各组间细胞因子水平比较

2.4 各组间ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA检测结果比较

三组间ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA水平差异有统计学意义(表4)，进一步分析发现，对照组ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA表达水平均高于银屑病进行期和稳定期患者，差异具有统计学意义(均P<0.05)。进行期银屑病患者ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA值与稳定期比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表4 各组间ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA检测结果比较

2.5 miR-124表达与Th17 Treg水平的相关性分析

经统计，对照组miR-124水平与Th17和Treg之间无相关性(均P>0.05)，而银屑病进行期和稳定期患者miR-124水平与Th17、Treg水平间均存在相关性(均P<0.05,表5)。

表5 miR-124表达与Th17 Treg水平的相关性分析

2.6 miR-124表达与相关细胞因子表达的相关性分析

银屑病进行期组、稳定期组、对照组TNF-α、IL-6、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA与miR-124表达之间均无相关性(P>0.05)，而IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-21和IL-23与miR-124表达相关(均P<0.05,表6)。

表6 miR-124表达与相关细胞因子及ROR-γt mRNA、Foxp3 mRNA表达的相关性分析

3 讨论

寻常型银屑病在我国的发病率达到了0.2%～3.0%，患者常常伴有反复的瘙痒症状，给患者的精神心理健康和生活质量造成了严重影响[13-14]。多数研究[15-17]表明该疾病的发生主要是抗原多肽通过抗原提呈细胞激活细胞，导致其他致炎性细胞因子等炎症介质产生增多，进而引起皮肤损坏。

Th17细胞作为一类新型CD4细胞亚型，在体内主要介导炎性反应的发生[18]。Treg细胞表面则持续表达CD25分子[19]，故分析寻常型银屑病的发生发展与Th17和Treg细胞分化平衡的相关性具有重要的意义。本研究结果发现，寻常型银屑病患者TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-21和IL-23的浓度明显高于对照组，TGF-β、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA水平低于对照组；进行期银屑病患者细胞因子水平和ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA与稳定期比较，差异均无统计学意义。miR-124水平与Th17、Treg、IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-21和IL-23之间均存在相关性，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，推测寻常型银屑病患者Th17和Treg细胞的分化失衡与miR-124表达有关。

本研究结果发现，进行期寻常型银屑病患者Th17/Treg比值较稳定期患者高，银屑病进行期组和稳定期组患者miR-124水平与Th17和Treg之间均存在相关性(P<0.05)；TNF-α、IL-6、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA与miR-124表达之间均无相关性(P>0.05)；IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-21和IL-23与miR-124表达之间均存在相关性(P<0.05)。这说明进行期患者Th17/Treg细胞出现了明显的失衡现象，推测Th17/Treg细胞失衡可能与寻常型银屑病的发病存在密切的相关性。当细胞转染miR-124模拟物后，促炎性细胞因子IFN-γ、IL-1a、IL-8和IL-12a等表达水平均不同程度降低；当细胞转染miR-124抑制剂后，上述促炎性细胞因子的表达水平不同程度增加[20]。由此可知，miR-124具有抑制促炎性细胞因子表达的作用，因此，miR-124的异常表达在寻常型银屑病的发生发展中发挥着重要作用。

综上所述，寻常型银屑病发生发展与Th17和Treg细胞的分化平衡有着密切的相关性，miR-124参与Th17和Treg细胞的分化有可能参与寻常型银屑病的发病机制。