双水相体系在酶催化药物合成中的研究进展

林锦良，陈小芳，李友凤

(遵义师范学院 化学化工学院，贵州 遵义 563002)

1 引言

酶是生物体内的蛋白质或核酸类催化剂，不改变反应方向和反应平衡时，可以改变化学反应的速度[1]。它既可以在生物体内发生作用，也可以脱离生物体，甚至在有机溶剂中起着催化作用。而且，酶具有高效性和专一性的特点，使其催化的反应具有效率高，副产物少的优点。同时，酶的催化反应可以发生在水溶液中、温度适中(室温)、pH值接近中性、离子浓度低和常压等条件中发生，反应条件温和[2]。因此，酶工程被广泛应用于各领域的研究，比如食品、制药、环境、检测、农业等。近年来，随着物质生活的不断改善，医疗健康引起了人们越来越多的重视[3]。在此背景下，人们开发了各种类型的药物中间体和药物的酶催化反应。然而，如上所述，酶源于生物体内，这意味着其一旦离开最佳反应条件，优势将被部分抑制直至完全失效。所以，获得耐受性强的酶和开发条件温和的体系是推广酶催化的药物合成反应在规模化生产应用中重要的途径。

生物催化剂最主要的就是需要有高活性, 而要在生产实践中运用则需要低成本[15]。自然界生物中存在丰富的酶资源，但能用于作为工业生产生物催化剂的不多，主要是因为酶的活性被一些工业的极端环境所限制(高温、高压、pH值等)，这种条件下容易失去活性。研究者为了克服这些难题，通常选择在极端环境中生存的微生物体内挖掘耐受极端环境的酶，比如rTaqDNA聚合酶的发现和应用[4]。但此种方法局限性大，而且不易培养。当然基因技术的出现在一定程度上促进了新酶发掘[5]。但获得耐受性高的酶大部分具有更强的目标性和不确定性，在实际生产中并未大规模应用。因此，酶催化的合成，目前最直接的途径是从生物体内合成提取，这样在获得药物时避免了特殊反应条件的配备。于是也有部分合成工艺在生物体内进行。这些途径都极度依赖目标生物体。为了实现脱离生物体的酶催化反应的条件，除了在酶的本身进行改造之外，人们不断地模拟各种相应生物体环境。这些反应环境主要包括以下几类：①水相反应体系，②有机相反应体系，③气相反应体系，④超临界流体，⑤离子液体，⑥双水相反应体系。

双水相体系是一类新型的且具有极大开发价值的酶催化反应介质。双水相体系一般由两种不同的聚合物，一种聚合物与一种亲液盐，或一种离散盐和一种亲液盐，并在适当的外部环境诱导下(溶质浓度、环境温度、光照条件、pH值等)形成[6]。双水相体系在反应中的优点主要是消除产物抑制和催化剂的分离。前者可以促进催化过程，提高反应速率；后者简化了产物的分离过程，有效地控制了成本[7]。非离子类型的双水相体系，具有离子强度低的特点。所用原料都是非挥发性成分，可循环利用，对操作环境造成较小影响，也被广泛认为是典型的绿色工艺。所以该体系与传统反应分离流程中的操作相比具有显著优势，是一种有效的包括药物合成在内的生物催化体系[8]。基于双水相体系和酶催化的优点，以及当前人们对新型药物的需求，本文将选用几种较为常见的例子进行论述。一方面，对药物的类型上进行分类，以获得相关的规律性，便于指导后续的相关研究工作；另一方面，对相关合成例子的扩展，使相关知识对运用于其它领域起到启示性作用。因此，通过本文的研究，使双水相体系中的酶催化药物合成技术期待在更多的领域得到关注和应用，促进该新型技术在产业化的发展。

2 不同种类药物的双水相合成

2.1 抗生素类药物的合成

2.1.1 氨苄西林

氨苄西林是广泛应用于临床治疗的一种抗生素，具有良好的抗菌能力和较小的毒副作用[9]。在合成氨苄西林的化学过程中，需要基团保护和去保护等苛刻条件以及产生毒性较大的氯等有机化合物，产生的废物难以回收利用，残留在环境中会污染环境。为了克服上述缺点，青霉素酰化酶催化合成氨苄西林反应条件温和，有机溶剂用量少，反应步骤简单，是环境友好型工艺[10]。但是需要投入大量原料，往往造成大量原料浪费，生产成本高导致经济利润不高，限制了大规模工业生产。Andersson等利用酶催化反应在以8.9%的聚乙二醇-2000/7.6%的磷酸钾溶液为基础的双水相系统进行氨苄西林的合成，并取得95%以上的酶回收效果[11]。邵晨等根据氨苄西林和生产原料的溶解性特点，采用亲水性离子[Bmim]BF4和盐溶液作为反应体系的双水相[12]。实验表明，该方法可以将氨苄西林的回收率提到70.79%，反应效率也同时得到很大提升。宋肖单等在聚乙二醇(PEG-4000，w=20%)和(NH4)2SO4,w=15%)组成的双水相体系中合成氨苄西林[10]。在该双水相体系中反应的产率达到了80%，与原水溶剂中其产率为27%相比具有明显的提高。而且在连续4次的合成之后，最高达到98%的产率。反应效率提高，源于产物溶解于上层溶液中，消除了抑制作用，化学平衡往正方向移动。此外，由于产物往上层聚集，也简化了产物氨苄西林的分离和纯化的过程。因此，采用双水相体系催化合成氨苄西林，极大的节约生产成本。

2.1.2 6-氨基青霉烷酸

目前，6-氨基青霉烷酸(6-APA)的重要合成前驱体是青霉素G。青霉素G本身对敏感病原体有强大的灭杀作用且毒性低微而被广泛使用，临床上常为抗菌药物的首选[13]。这种中间体抑菌能力小且可以通过引入不同侧链来获得许多药效不同的青霉素。但使用青霉素酰化酶使青霉素G 裂解时发现，这种应用存在产物抑制，并且青霉素酰化酶不稳定，产率低下。因此，一种具有光敏性质且可循环利用的聚合物被合成[14]。Dextran与该高聚物形成双水相体系，该双水相体系可用于催化青霉素G使其裂解为6-APA，可解除产物或者底物的抑制，使产率大大提高。

2.1.3 头孢霉菌类抗生素

头孢氨苄是一种半合成的第一代口服头孢霉菌类抗生素药物。该类药物的作用机制是通过抑制菌类细胞壁的合成，导致细胞内容物膨胀至破裂，实现杀死细菌。朱建航等构建了20%聚乙二醇400/15%硫酸镁组成的双水相体系，并证明该体系在酶催化合成头孢氨苄显示了高效的性能。头孢氨苄在聚乙二醇上相进行富集、青霉素酰化酶在硫酸镁下相分配[15]。通过两相之间组分的萃取，消除产物抑制并打破化学反应的平衡，使反应平衡向有利的合成反应方向进行，最终的结果可将产率从单一水相的20%提高到60%左右。

头孢丙烯也属于一种口服头孢霉菌类抗生素药物，可抑制细菌细胞壁的合成，主要用于治疗复发性、急性中耳等呼吸道感染。头孢丙烯的安全性和临床型治疗使其成为一种具有竞争力的治疗抗生素，但其传统的合成方法及化学技术成本极高[16]。Pan等采用以7-氨基-3-(1-丙烯基)-4-头孢菌酸母核和(R)-氨基-(4-羟基苯基)乙酸甲酯盐酸盐为酰基供体，在以丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲胺乙酯和甲基丙烯酸丁酯为原料合成的PADB和PMDB组成的双水相体系，用固定化青霉素酰化酶催化合成头孢丙烯[17]。因其组成双水相体系的两种共聚物有易于放大、回收率高等特点，可用于进一步地工业化生物分离。

2.1.4 6-甲基氢化可的松

甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物。在甾体药物或其中间体的合成路线中,微生物转化是不可或缺的关键环节。通过甾类药物 A 环Δ1 脱氢可以提高药理活性和降低副作用[20]。但是在该脱氢过程面临着甾类底物在水溶液培养基中的溶解度差的问题，降低了转化效率。当大量的反应底底物集中在一相时，也存在不同程度的产物(底物)抑制[21]。孙新宇等在对PEG/Dextran双水相体系进行选择和优化后甾类化合物6-甲基氢化可的松的生物转化[22]。利用简单节杆菌内Δ1脱氢酶在配比为16% PEG 20000/4% Dextran 40000的双水相体系中将6-甲基氢化可的松脱氢转化为6-甲基泼尼松龙。双水相体系脱氢转化率比传统技术提高了25%～30%，并且增大了底物的投料浓度。

2.2 神经类药物(普瑞巴林)

普瑞巴林((S)-(+)-3-氨基甲基-5-甲基己酸)是一种亲脂性物质4-氨基丁酸(GABA)类似物，作为LyricaTM上市用于治疗癫痫[18]。虽然普瑞巴林最初是用于部分癫痫的辅助治疗，但最近的研究表明，它对神经性疼痛、疱疹后神经痛和焦虑障碍的治疗有效[19]。(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)是普瑞巴林的关键手性中间体。Wu[14]等在研究了几种由无机盐和亲水溶剂组成的双水相体系从生物转化发酵液中提取(S)-CMHA的可行性后。经过5种亲水溶剂和盐类测试中，结果表明：硫酸铵和丙酮是提取(S)-CMHA的最佳双水相体系。在对比几次试验后结果表明(S)-CMHA在中性和碱性条件下更稳定，且其(S)-CMHA的回收率高达99.15%。这些结果表明：两步法是大规模提取(S)-CMHA的一种有前途的策略。因此双水相体系酶催化为其提供了良好的酶促反应分离能力，并且增大了酶与产物的回收效率。

2.3 氨基酸类化合物

2.3.1 2-甲基-L-色氨酸

2-甲基-L-色氨酸是抗菌素硫链丝菌肽合成中重要的中间体，含有2-甲基色氨酸的寡肽化合物可以使亲躯体细胞释放生长素，使动物的生长速度加快[23]。徐礼生等在水/有机溶剂双相中，以L-丝氨酸和2-甲基吲哚为底物，利用重组大肠杆菌DM206种子液[pETDuettrpBA+trpA/BL21(DE3)]色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸，并优化了其转化条件[24]。通过增加体系中有机相浓度提高了酶反应速率，大大缩减了整体的反应时间，显示出了绿色高效的合成方法。

2.3.2 L-苯丙氨酸

L-苯丙氨酸作为人体所需的八大氨基酸之一，在食品、医药领域有广泛的应用[25]。苯丙氨酸可以作为饮料添加剂，添加到食品中，还可作为一些药物的中间体。徐虹等用两菌双酶法由苯丙酮酸生产L-苯丙氨酸[26]。孙广海在经过多次试验后最终选定20%PEG 1000/16%磷酸钠盐为双水相酶法转化L-苯丙氨酸最佳的双水相体系[27]。在转氨酶的作用下大肠杆菌细胞与底物大都被分配到了上相，而产物 L-苯丙氨酸相当大一部分被分配到了下相。由于双水相体系对细胞酶活力起稳定作用，在多批次转化中，产物的转化率相比于传统水相体系的转化率提高了27.4%。

2.4 复合凝胶微球的制备

在药物发挥作用的过程中，除了目标分子的直接效用，辅助成分也起着重要的作用。凝胶微球在控制药物释放速率、包裹与封存固定化酶领域发挥着重要的作用，其中在传递系统中的涉及的蛋白类分子尤为突出，因此研究也更为广泛[28，29]。海藻酸钙凝胶因其具有良好的生物相容性、降解性、粘附性，无毒害等特点而被广泛应用于此类研究[30]然面，单组分的海藻酸钙面临着包埋率低的问题，使它的应用在一定程度上被限制。孟世昕利用微滴柱法在双水相系统与海藻酸钙凝胶材料结合生成一种新型复合凝胶微球，除了提高单分子蛋白的包埋率，还将实现有效组分的可控释放[29]。与传统工艺相比，复合凝胶微球对BSA拥有超过90%的包埋率，并验证了其拥有更加稳定的结构及强度，且将会适用于多种环境的应用中。

3 结论与展望

本文研究了双水相体系中酶催化反应在药物合成方面的几个应用，突现了双水相体系中酶催化的优势。考虑到化学反应与酶催化工程发展的要求相结合，双水相体系具有廉价易得，条件温和便于循环利用，以及在催化反应中可以消除底物/产物抑制等特点而被广泛研究。但由于双水相也有一些的自身特点限制了其自身的发展。如果想要提取产物，需要使得两相混合分离，分离步骤将需要反应分离过程耗时耗能。此外，不同的生物活性物质在不同的双水相体系中也具有不同的分配比例，没有一种普适性的双水相体系适合所有的酶催化反应，导致需要不断地探索发现双水相与酶催化反应的契合度。影响溶质在双水相体系中分配比的因素有很多，比如形成双水相的种类及浓度、溶质本身的电荷、分子量、浓度等特性，而萃取的耦合的关键在于需要底物，酶催化剂和产物的分配倾向于不同的相中，这大大增加了选择合适双水相体系用于酶催化反应的难度。双水相体系中酶催化反应相对于传统工艺有非常大的优势，值得利用其进行更好地发展。双水相体系进行反应，产物转化率高，反应时间较短，经济，绿色，表明双水相体系有较好的应用前景。