MeJA和蔗糖草莓果实采后灰霉病抗性中的作用研究

王媛花

（江苏农林职业技术学院,江苏 句容 212400）

目前我国草莓的种植主要以温室大棚为主，由于种植技术、环境条件等因素的限制，导致草莓的病害日趋严重[1]，其中，灰霉病是草莓生产中的一种世界性病害，其病原菌为灰葡萄孢菌 (Botrytis cinerea Pers.，B.cinerea)。B.cinerea被认为是非常重要的致病性死体营养型真菌，染色体组分析表明B.cinerea 能分泌大约40种毒素，在采前和采后都会侵染草莓果实，造成果实腐烂，导致果实不能食用[2-4]。草莓一旦感染灰霉病，病果率一般在30%～60%，严重的情况下甚至绝收，会给草莓生产造成巨大的损失[5]。

茉莉酸(Jasmonic acid，JA)及其挥发性甲酯衍生物茉莉酸甲酯(Methyl-jasmonate，MeJA，也称为甲基茉莉酸)和氨基酸衍生物统称为茉莉酸类物质(Jasmonates，JAs)，也称为茉莉素、茉莉酮酸和茉莉酮酯，是植物体内起整体性调控作用的植物生长调节物质[6-9]。近年来，有关茉莉酸和蔗糖处理草莓的相关研究发现，其不仅对于草莓果实发育与成熟方面有一定调控作用，而且以MeJA处理草莓能有效抑制草莓中由灰霉菌引起的灰霉病[10]。蔗糖是调控植物生长发育的信号分子，相关研究发现蔗糖能够和茉莉酸共同作用促进草莓果实成熟[11]。但是蔗糖对灰霉病影响的研究还很少，因此本研究就对茉莉酸甲酯与蔗糖对草莓果实灰霉病影响的的分子机理做初步探讨，旨在为后续开展草莓抗病研究工作提供一个研究基础，也可以为未来草莓的抗病育种工作提供一条新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究试验于2017年11月—2018年5月，在江苏农林职业技术学院进行。

实验所用的“红颜”(Fragaria × ananassa ‘Benihoppe’)草莓果实材料均来自江苏农林职业技术学院草莓玻璃温室。试验过程中，用来进行果实采后处理的植物生长调节剂茉莉酸甲酯和蔗糖购买自来自SIGMA-ALDRICH，吐温20来自国药集团化学有限公司。各生长调节剂在超净工作台上配置成所需浓度，冷藏备用。灰霉菌(Botrytis cinerea Bc)由本校生物工程中心从田间分离所得。病菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。病菌经过常规方法纯化以后，接种至PDA培养基上，在25 ℃恒温箱中培养14 d。然后在超净工作台上将培养基切下放入装有无菌水的锥形瓶中，振荡10 h后用4层纱布过滤，显微镜镜检调整，制备孢子悬浮浓度为1×105 cfu/mL悬浮液，用于果实病菌处理[12-15]。

1.2 主要试剂配方

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：200 g马铃薯去皮、去芽眼切成黄豆大小，用略多于所需量的水煮20 min左右，至其软而不烂，再用4层纱布过滤，然后加入20 g/L琼脂、20 g/L葡萄糖，定容至1 000 mL，高温灭菌，备用。茉莉酸甲酯JA：500μmoL/L+0.02% 吐温-20[16-18]。

蔗糖：15mmol/L+0.02% 吐温-20[10]。

对照：无菌水+0.02% 吐温-20。

1.3 试验方法

1.3.1 MeJA和蔗糖处理采后草莓果实后的发病规律观察

摘取成熟的草莓果实，用配置好的MeJA和蔗糖处理后，直接喷施果面，每24 h喷一次，共3次。第3次喷完待12 h后，用无菌注射器针头在果实上扎1个小孔，再用配置好的灰霉病悬浮液进行果面喷施。观察不同处理环节中草莓果实的发病情况。试验过程要求置于20 ℃恒温环境，空气湿度达到80%以上，光周期16 h/8 h。从果实处理开始每天拍照，直至完全发病。试验重复3次，重复试验时，每次处理果实50个。果实处理过程中，统计发病率和病情指数。

1.3.2 草莓果实中抗病基因表达量检测

分别提取不同药剂处理和发病情况的草莓果实的RNA，反转录为cDNA。选取与草莓抗灰霉病相关的基因16个，转录据NCBI数据库中的基因序列，设计目的基因荧光定量引物（见表1），并比对验证，确认无误后，采用实时荧光定量PCR（qT-PCR）方法，检测各基因相对表达量。qT-PCR使用仪器为Roche公司的荧光定量LightCycler 96仪，各个基因和内参Actin 基因的反应总体系为20 μL，其中包含10 μL Til RNase Plus (2x)，1 μL 上下游引物混合液，1 μL cDNA，8 μL无核酸污染的ddH2O，反应程序：95℃预变性30 s；PCR定量分析95 ℃变性5 s，60 ℃退火 30 s，40个循环后，进行溶解曲线分析：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，最后降温：50 ℃ 30 s，程序结束，用Roche的LightCycler 96 SW 1.1软件分析各功能基因相对表达量。

表1 实时荧光定量 PCR引物序列

1.4 数据统计分析方法和果实发病等级划分

所有基因表达量采用2-ΔΔCT法来计算相对表达量。用植物生长调节剂处理的果实内各功能基因的表达量均以用水处理果实的相应基因表达量为对照。表达量按照上调下调倍数的方式，以不同颜色作为表达量上调或者下调的倍数。

发病率在灰霉病处理96 h时统计，后发病率=（发病的果实/处理果实）×100%。

病果级率=（该病果级的病果数/所有发病的果实）100%。

病果级按照图1中的标准来划分：

图1 草莓果实发病等级划分标准

2 结果与分析

2.1 MeJA和蔗糖处理草莓果实后的发病规律分析

从试验结果（见图1）可以看出，用MeJA和蔗糖处理后的草莓果实与对照相比，灰霉病开始发病时间都差不多，都在接种灰霉病73 h开始发病。但是用MeJA和蔗糖处理后发病的程度与对照相比要轻很多。处理96 h后，对照大部分果实发病已经很严重了，而用MeJA和蔗糖处理的果实发病症状依然很轻。从表2的发病率统计和发病程度的统计上来看，MeJA和蔗糖处理的果实发病程度显著更轻于对照。从这个结果能够推断出，MeJA和蔗糖对于采后草莓灰霉病的发生中是有一定作用的。

表2 对照和处理草莓果实接种灰霉病后发病情况

2.2 草莓果实中相关抗病基因的表达量分析

从图3的试验结果可以看出，与抗病相关的基因，在MeJA和蔗糖处理后与对照相比都受到不同程度的调控。而蔗糖处理后这些基因的调控更为明显。在被MeJA处理的果实中，除MYB10、WRKY70基因外，所有与MeJA合成有关的基因均为负调控，而WRKY1基因的变化倍数达到了2～5倍，MYB10基因的变化倍数则达到了10倍以上，结合前面发病率数据，可以推测其对于灰霉病有不小的抗性。而在蔗糖处理果实中，除ERF3、MYB44.3、PR4、WRKY25及WRKY33基因外，皆为正调控，其中，AMY3基因的变化量达到2～5倍，bHLH3基因为5～10倍，而MYB10、WRKY1更是在10倍以上，结合前面发病率数据，也能推测这四个基因的过量表达也许能减轻灰霉病病果的发病程度，并且MYB10和WRKY1这两个基因在两种药剂处理中都表现为2倍以上的正调控，在后续研究中需重点关注。

图2 草莓果实处理后接种灰霉病发病进程观察

图3 抗病基因表达量分析

3 讨论

茉莉酸类化合物在植物抗逆基因中起着重要的作用。草莓作为重要的园艺作物，对其各功能基因在抗灰霉病方面的影响分子机理研究，能够为草莓抗逆改良提供理论依[19-21]。目前已经从草莓中分离鉴定出各种功能基因，并对其基因组分布、分子特征、系统进化等方面进行了分析。草莓灰霉病作为灰霉病是较为普遍且严重的病害之一，而且果实和叶片中都能感病，因此给草莓产量造成了很大的损失[2-3]。目前，普遍而有效的防治灰霉病的方法是化学药剂防治，化学药剂会使灰霉病产生抗药性[16]。要从根源上解决，只有培育抗病品种才能最大限度地降低其危害，而分子育种是最为直接有效的方法，所以应该寻找各种有效的抗病基因为后续的育种工作提供素材，并进一步筛选出更好的目标基因，逐步提高良种素质。

本试验用茉莉酸甲酯和蔗糖处理采后草莓果实，对草莓发病规律做了相关研究，同时用实时荧光定量技术从抗病基因的表达量变化方面研究分析了其对于灰霉病的影响。研究结果表明，MeJA和蔗糖处理均对果实灰霉病的抑制有正向作用。期间发现了一些抗病相关基因（比如MYB10和WRKY1等）在处理后调控倍数明显，因此可以推断这些基因在灰霉病的抗性方面有关键作用，有可能在草莓中起到抗灰霉病的作用。本研究对深入解析草莓抗病的分子机理具有参考价值，同时为抗病育种研究提供了一条新的方向和思路。