甘露糖化壳聚糖纳米粒靶向巨噬细胞的应用研究进展①

严丽丽 谢 勇 闵卫平③ （南昌大学第一附属医院，南昌330006）

巨噬细胞源自单核细胞，存在于各种组织中，与全身的疾病发生发展相关，在体内发挥先天性免疫和细胞免疫作用。由于其表型和功能具有多样性特点，靶向巨噬细胞并调控其功能已成为治疗疾病的重要方法［1-2］。其中通过调节巨噬细胞相关受体，由受体介导的靶向系统治疗相关疾病已成为研究热点［3-4］。壳聚糖（chitosan，CS）作为非病毒载体具有良好的生物相容性和安全性，且负载效率高，可作为优良载体的首选材料［5］。对CS 进行配体修饰，枝接甘露糖，可得到由巨噬细胞表面高表达的甘露糖受体（mannose receptor，MR）介导的主动靶向巨噬细胞的基因和药物递送系统。近年来，新型药物的出现及外来基因编辑对许多复杂性疾病具有巨大的治疗潜力，甘露糖化壳聚糖纳米载体经靶向递送将携带的基因或药物递送至目标部位，能够达到更加安全高效的治疗效果［6］。

1 甘露糖化壳聚糖纳米粒的特性

纳米材料具有生物相容性好和靶向性特点，可通过与生物大分子（多肽、糖类、叶酸等）间的特异性相互作用提高靶向性能，因此被广泛应用于生物医学研究和靶向递送［7］。其中壳聚糖纳米粒作为负载药物和基因的优良载体，成为近年来生物材料的研究热点，并在医药、生化和生物医学工程等领域广泛应用［8］。

CS又称脱乙酰甲壳素，化学名称为聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-B-D 葡萄糖，相其对分子质量从数十万到数百万［9］。由于CS 是自然界唯一的聚阳离子碱性多糖，具有低毒性、生物相容性、结构易修饰等特点，可作为良好的生物纳米材料。但CS作为载体缺乏细胞特异性和主动靶向性，不能发挥特异性靶向作用。在生物大分子纳米材料中，甘露糖基纳米材料在靶向治疗方面取得了很大进展，并为免疫调节治疗提供了有效靶点［10］。MR 属于多凝集素受体，可通过受体介导的内吞作用维持内环境的稳定，启动特异性免疫应答，对于有效治疗各种疾病至关重要［11-12］。MR 作为该家族的原型，已成为配体靶向的模型受体，通过与优良载体结合，负载基因、药物和疫苗等方法被广泛研究［13-14］。因此，对CS 进行配体修饰，得到甘露糖化壳聚糖纳米粒（manno⁃sylated chitosan nanoparticles，MCS-NPs），通过巨噬细胞表面高表达的MR 介导的主动靶向作用，可作为安全高效、特异性靶向的优良载体。

靶部位、目的基因或药物、转运载体三者的特异性结合是靶向递送系统治疗疾病的关键。由于纳米粒子的表面效应和小尺寸效应，对药物具有可控性释放作用以及能够保护基因免受核酸酶的降解，已用于多种疾病尤其是癌症方面的治疗［15-16］。因此，利用纳米载体与配体结合制备的MCS-NPs，不仅生物相容性及稳定性良好，毒性低，并且能够使药物或基因特异性靶向，增加靶部位的摄取量，从而提高药物的生物利用度和基因的转染效率，达到更加安全高效的治疗效果。

2 MCS-NPs的制备方法

目前制备壳聚糖纳米粒的主要方法有复凝聚法、聚电解质络合法、离子凝胶法、微乳液法、共价交联法、溶剂蒸发法、共沉淀法等［17］。CS 及其衍生物经修饰后制备纳米粒的方法与壳聚糖纳米粒相似，其中复凝聚法和离子凝胶法是制备CS及其衍生物最常用的两种方法。STIE 等［18］用离子凝胶法制备了180~280 nm 的壳聚糖纳米粒，装载BSA 和p53至人皮肤黑色素瘤细胞。研究表明，利用离子凝胶法制备的纳米粒能够有效促进细胞对蛋白质的摄取，该方法制备的药物或基因递送系统在体内外的生物医学应用中具有重要价值。YAO 等［19］利用复凝聚法制备了甘露糖化壳聚糖（MCS）包裹胃泌素释放肽（pGRP）质粒，形成了约为210 nm 的MCS-pGRP-NPs，以抗原提呈细胞为靶点，经小鼠鼻腔黏膜给药，通过纳米载体提高疫苗接种效果。实验结果表明，MCS-NPs 是一种高效的靶向基因传递载体，MCS-pGRP-NPs 能够与巨噬细胞上的C 型凝集素受体结合，通过MR 介导的内吞作用增强细胞摄取，对抗肿瘤免疫治疗具有潜在应用前景。纳米粒子的大小、稳定性及毒性等都与制备工艺有关，根据实验需要，选择合适的制备方法，达到研究目的。

3 壳聚糖纳米载体负载基因和药物的作用机制

CS是天然存在的阳离子聚合物，其结构中的游离氨基使其带有正电荷，生物黏膜表面的类脂层荷负电，易与CS 中的阳离子发生静电吸附，增强被负载基因和大分子药物透过黏膜吸收的能力［20］。壳聚糖纳米粒子在酸性溶液中带正电荷，能够与带有负电荷的DNA 通过电荷间的相互吸引迅速涡旋混合形成纳米级复合物。因其静电吸引通过空间位阻效应，使得DNA 免受核酸酶的降解，并且形成的纳米级复合物有利于细胞对基因的摄取，延长了药物在体内的滞留时间，减少胃肠道对药物的降解，提高药物的生物利用度，使得纳米递送系统在疾病治疗中发挥重要作用［21-22］。

因此通过对CS进行配体修饰得到MCS-NPs，由甘露糖受体介导携带药物和基因特异靶向巨噬细胞的递送系统，能够发挥更高效的治疗作用［23-24］。

4 MCS-NPs在疾病中的治疗作用

4.1 MCS-NPs 药物递送系统在疾病中的治疗作用 纳米载体药物递送系统由于其优良的性能，在疾病治疗应用方面日益扩大，在治疗肿瘤相关疾病方面尤为突出［25］。经配体修饰后的纳米载体，不仅能够促进药物吸收，改善药物在体内的分布，还能高效靶向目标部位，从而提高药物的生物利用度，达到更好的治疗效果［26-27］。

图1 MCS-NPs负载基因或药物系统靶向巨噬细胞结构图Fig.1 Structure of MCS-NPs gene/drug delivery system targeting macrophages

ESFANDIARI 等［28］及 AFZAL 等［29］研究 了 口服巴龙霉素（PM）对内脏利什曼病的治疗效果。由于PM 的口服吸收率低，半衰期短，药物效价低，因此，ESFANDIARI 等［28］合成了MCS，包裹PM，与右旋糖苷制备成MCS-dex-PM-NPs。实验表明该纳米传递系统对巨噬细胞具有高效靶向性，低细胞毒性，对利什曼原虫感染具有良好的治疗效果。AFZAL等［29］利用甘露糖-硫醇化壳聚糖（MTC）与聚乙酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）包裹PM 制备MTC-PLGA-PMNPs，与游离的 PM 相比，MTC-PLGA-PM-NPs 在利什曼原虫感染的巨噬细胞模型中，巨噬细胞对其摄取能力和杀虫能力增强。体内研究显示MTC-PLGAPM-NPs 治疗后杜氏利什曼原虫感染的BALB/c 小鼠模型中的寄生虫的数量大大降低。CHAUBEY等［30］合成了 MCS，包裹姜黄素，制备成 Cur-MCNNPs，研究其对利什曼原虫的疗效和毒性评价。体内外实验结果表明，与壳聚糖纳米粒包裹的姜黄素及直接作用的姜黄素相比，Cur-MCN-NPs 对治疗利什曼病具有更显著的效果。

XU等［31］将MCS包裹牛血清白蛋白（BSA），并利用聚丙烯酸树脂肠溶包衣制备成BSA-MCS-Edu-NPs。研究表明，该纳米粒在胃肠液中具有良好的稳定性，被负载的BSA 主要通过M 细胞促进其在PP结中的积累量以及提高对抗原提呈细胞的靶向能力，从而诱导较强的系统性免疫应答，为口服疫苗的接种提供新的思路。黄燕等［32］研究了甘露糖化羧甲基壳聚糖包裹依替膦酸形成纳米粒子靶向M2型巨噬细胞治疗恶性肿瘤。结果显示，甘露糖化羧甲基壳聚糖与依替膦酸复合物对M2 型巨噬细胞具有靶向能力，MCS-NPs 靶向巨噬细胞作为治疗肿瘤的研究靶点具有重要的临床意义。

细菌感染仍然是死亡的主要原因之一，细菌耐药性的出现对人类健康构成了巨大的威胁。COYA等［33］利用甘露糖修饰的三甲基壳聚糖纳米粒（MTCNPs）研究巨噬细胞对细菌感染的反应，应用新的纳米治疗策略提高疗效。作者使用结核分枝杆菌作为细菌感染的模型，研究MCS 纳米载体对人体巨噬细胞反应的影响机制。研究发现，MTC-NPs 在很大程度上改变了结核分枝杆菌感染巨噬细胞的反应，通过mRNA 测序显示，由于MTC-NPs 的摄入，近900个基因出现差异表达。进一步结果分析显示，这组被调控的基因参与细胞代谢，尤其是氧化磷酸化和糖代谢途径。因此，将具有调节代谢的纳米颗粒与药物相结合，是治疗该类疾病的一种有效策略。

壳聚糖及其衍生物本身作为一种药物辅料具有较理想的安全性能，使得CS和纳米粒子作为药物载体的研究在多领域迅速发展［34］。随着MCS-NPs载体的优良特性逐渐展现，在治疗各种疾病中起到了良好的应用。

4.2 MCS-NPs 基因递送系统在疾病中的治疗作用 基因治疗是指将外源基因导入靶细胞，通过基因表达来治疗或预防疾病的潜在方法［35］。制备安全有效的基因载体是基因治疗的关键，MCS 作为可降解、低细胞毒性的非病毒基因载体，在基因治疗中发挥重要作用［36］。

ASTHANA 等［37］将 MCS 包 裹 反 义 寡 核 苷 酸（AON）制备成纳米粒靶向递送至巨噬细胞，考察其纳米粒复合物的特性，以及AON 体外转染至巨噬细胞的效率。研究发现，MCS 作为巨噬细胞的靶向载体，具备基因递送系统的理化性质，MCS-NPs 是一种安全有效的基因载体，对RAW264.7 细胞无明显细胞毒性，并且具有较高的基因转染效率。YAO等［19］利用 MCS 装载 pGRP 质粒制备成纳米粒，研究其对巨噬细胞的靶向能力和转染效率。结果显示，MCS 能够保护pGRP 不被核酸酶降解，与CS 相比，MCS 通过MR 介导的内吞作用能够提高转染效率。因此，以巨噬细胞MR 为靶点的MCS 纳米载体具有潜在的应用价值。

HE 等［38］利用双靶向纳米载体递送寡核苷酸（ODN）至巨噬细胞克服肿瘤相关免疫抑制。由于甘露糖受体和CD44 受体在巨噬细胞表面高表达，作者制备了双靶向甘露糖化羧甲基壳聚糖-透明质酸-硫酸鱼精蛋白/寡核苷酸纳米粒（MCMC/HA/PS/ODN/NPs），与单靶向的 HA/PS/ODN/NPs、MCMC/PS/ODN/NPs 及非靶向的 CMC/PS/ODN/NPs 相比，在靶向性评价、细胞毒性、肿瘤抑制等方面，双靶向MCMC/HA/PS/ODN/NPs 可实现巨噬细胞的高效靶向，低毒性，并能显著增强免疫刺激。因此，双靶向载体负载的CpG-ODN 在肿瘤治疗中具有良好的应用前景。DENG 等［39］通过纳米载体将 miR-146b递送到肠道巨噬细胞治疗溃疡性结肠炎。作者通过甘露糖修饰三甲基壳聚糖包裹miR-146b，制备成MTC-miR-146b-NPs，研究了miR-146b 在小鼠结肠炎模型黏膜修复过程中的表达水平、DSS 诱导的结肠炎模型中对小鼠黏膜的再生情况及miR-146b−/−小鼠CAC的抑制作用。结果显示，MTC-miR-146b-NPs具有高的包封效率和延时作用，可选择性地靶向肠道巨噬细胞而无细胞毒性，可作为肠道疾病研究的有效载体。MTC-miR-146b-NPs 可作为口服给药的有效候选药物，提高溃疡性结肠炎和结肠炎相关癌症的免疫治疗效果。

基因治疗的有效性在很大程度上取决于基因递送系统的优良特性：靶向性强、细胞毒性低、基因免受核酸酶降解、基因转染效率高等特点。基于CS及其衍生物，经配体修饰后由受体介导的靶向载体具有很大的治疗潜力，近年逐渐成为疾病治疗的热点研究方向。

5 结语

综上所述，CS 作为非病毒载体，对其进行结构修饰，形成受体介导的靶向递送系统，已经被广泛尝试应用于基因和药物递送。MCS-NPs 安全高效，提高了药物的利用度和基因转染效率，在疾病治疗中发挥重要作用。但配体枝接CS 主动靶向系统也存在一些局限性，例如工艺过程中目的产物产率，纳米复合物的稳定性，如何精确控制纳米粒径，对工艺参数的优化和从实验室到中试工厂再到生产水平的规模化等问题还有待进一步研究。现有的研究大多局限于细胞和动物水平的研究，仍需要进行更多临床试验相关的体内外研究。然而，经配体修饰的主动特异性靶向递送系统已在疾病治疗中显示出了良好的性能，具有潜在的应用前景和临床价值。