胞质DNA感受器cGAS的研究进展①

谭 星 庞晓燕 郝秀静 李 敏

（宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川750021）

当机体受到病原体入侵或自身发生损伤时，机体内的天然免疫系统会做出快速响应，首先通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）监测到细胞内外及细胞质基质环境中的病原入侵或细胞损伤等危险信号，然后识别特异病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）或损伤细胞释放的损伤相关分子模式（danger-asso⁃ciated molecular patterns，DAMPs），二者的激活会引发信号传导级联反应，从而导致细胞自主防御机制的启动，以及可溶性介质（如Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子）的产生［1-3］。研究已经证明多种PRRs 的存在，如位于细胞膜上的C 类外源凝集素受体（C-type lectin receptors，CLRs）、位于细胞膜及胞内体膜上的Toll 样受体家族（Toll-like receptors，TLRs）、位于 细 胞 质 中 NOD 样 受 体（NOD-like receptors，NLRs）、位于细胞质中的视黄醇诱导蛋白受体RIG-Ⅰ样受体（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs），还有在细胞质中新发现的环磷酸鸟苷-腺苷合酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS），其是第二信使——环磷酸鸟苷酸腺苷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine mono⁃phosphate，cGAMP）的合成酶，是一种普遍认可的DNA感受器［4-6］。cGAS可识别外源DNA及机体自身损伤细胞外露的核质或线粒体DNA，诱导先天性免疫激活，产生促炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素，因此cGAS 在真核细胞中的固有免疫发挥重要作用［7］。本文将对cGAS及其功能最新研究进展进行综述。

1 cGAS概述

2013 年陈志坚团队通过一系列的质谱分析和蛋白质纯化技术发现了一种新的DNA 感受器——cGAS［6］。cGAS 是由 522 个氨基酸组成、分子量约60 kD 的蛋白质，是核苷酸转移酶家族中的一员，含有1个核苷酸转移酶结构域和2个主要的DNA 结合结构域，N 端是由大约130~150 个残基构成的不完全保守、非结构化的延伸片段，中间段为保守的核苷酸转移酶基序NTase 结构域，C 端为Mab21 结构域［6，8-9］。cGAS C 端结构域中有 1 个高度保守的锌囊结构，结构中的锌离子主要起维持蛋白结构作用，该结构是cGAS 识别双链DNA（dsDNA）的重要位点之一，抑制其将导致无法识别dsDNA［10-12］。没有dsDNA 时，cGAS 处于自我抑制状态，当与 dsDNA 结合后，诱导cGAS 催化中心构象变化，暴露出酶的活性中心，cGAS 氨基酸残基R150 和R192 插入到与DNA 结合后的双螺旋空隙中，稳固cGAS-DNA 复合体［13-15］。对 cGAS-DNA 晶体结构的研究发现，cGAS主要与DNA 的磷酸-核糖骨架结构结合，不与碱基结合［10，15-17］，cGAS的激活不依赖核苷酸序列，这解释了cGAS 能够识别几乎所有类型DNA 的原因，单链DNA 只要能够形成短的碱基配对片段也能激活cGAS，但激活的结构基础仍有待确定［18］。cGAS 与dsDNA的结合与长度和浓度也有一定关系，当dsDNA长度大于16 bp时，才能有效跨越cGAS二聚体的2个DNA 结合位点激活酶活性，大于45 bp 时，可引起更强的酶活性［17］；在低 DNA 浓度下，由 DNA 刺激产生的Ⅰ型干扰素只与cGAS 和dsDNA 的长度有关，小于20 bp 的dsDNA 只有在cGAS 浓度很高时才能在体外诱导cGAS催化活性［19］。

目前cGAS 的定位仍存在争议，现可通过蛋白纯化、免疫印迹、免疫荧光和质谱分析等技术检测cGAS，最先陈志坚团队从THP-1 细胞制备胞质和核提取物，通过免疫印迹在胞质提取物中检测到cGAS，共聚焦免疫荧光显微镜观察到cGAS 蛋白分布在细胞质中［6，20］。但 BARNETT 等［21］通过对THP-1细胞cGAS 的亚细胞定位和功能的详细分析得出结论：cGAS不是胞浆蛋白，而是由cGAS N 端的磷脂酰肌醇4，5-双磷酸酯介导的膜蛋白，并发现N-末端结构域均匀地分布在所有被检测细胞类型的质膜上，认为 N 端是一个定位结构域。GENTILI 等［22］通过分析与 BARNETT 等［21］的研究一致的 cGAS 突变体，发现没有N-末端结构域的情况下，cGAS 在细胞核内积累，且这种积累与基础天然免疫激活增加有关，但当单独表达时，cGAS 的N-末端结构域也定位于细胞核，而不是BARNETT 等［21］报道的质膜，但通过位于残基161 和212 之间的N-末端区域活跃地保留在细胞质中。与此同时另一项研究证明中，VOLK⁃MAN 等［23］研究发现在细胞周期的所有阶段，在所有被实验细胞中，绝大多数激活前的内源性cGAS 定位于细胞核，且其位置与细胞周期阶段或cGAS 自身激活状态无关。因此cGAS 的亚细胞定位仍需要深入研究［24］。

2 cGAS-cGAMP-STING通路

cGAS 作为DNA 感受器的作用机制主要依赖于cGAS-cGAMP-STING信号通路［25］。既往研究已经证明，STING 是双链DNA 诱导的天然免疫反应中关键的信号传导蛋白，是一种跨膜蛋白，在巨噬细胞、内皮细胞、树突状细胞、T 细胞等中广泛存在，在DNA感受通路中起重要作用，且STING 在体内与DNA 共定位，但在体外仅以低亲和力结合DNA，进一步证明了 cGAS 的存在［6，13，26-27］。cGAS-cGAMP-STING 信号通路的作用方式如下：首先cGAS 与DNA 结合诱导了cGAS 活性位点结构的变化，从而催化ATP 和GTP 合成 cGAMP［6，13，16-17］。cGAS 合成的 cGAMP 含有2 个磷酸二酯键，一个位于 GMP 的 2'-OH 与 AMP 的5'-磷酸之间，另一个位于 AMP 的 3'-OH 与 GMP 的5'-磷酸之间，cGAS 催化形成2'-5'键，随后通过环合作用形成3'-5'键，这种cGAMP 异构体称为“2'3'-cGAMP”［10，28-30］；接下来 2'3'-cGAMP作为第二信使是IFN 基因的衔接蛋白刺激物（STING）的内源性高亲和力配体［13，28，31-32］，其具有独特的 2'-5'磷酸二酯键，可结合下游信号分子 STING［10，30］，诱导 STING 构象发生变化，形成有活性的STING 二聚体，STING 的二聚化是产生IFN 的关键条件。随后STING 从内质网转移到高尔基体，在这个过程中STING 的羧基末端结合并激活激酶TBK1，进而促进干扰素调节因子（IFN regulatory factor 3，IRF3）磷酸化，磷酸化的IRF3 二聚体然后进入细胞核，同时STING 也激活激酶IKK（IκB kinase）促进NF-κB 的磷酸化，一起转移进入细胞核，诱导干扰素和炎症细胞因子表达（图 1）［26，31，33-37］；同时在 STING 激活的下游也会导致NF-κB 的激活，但激活机制目前尚未明确。另外cGAMP还可通过细胞间的缝隙连接从一个细胞转移到相邻细胞，激活相邻细胞STING扩大信号的传导。

图1 cGAS-cGAMP-STING信号通路示意图［37］Fig.1 Schematic diagram of cGAS-cGAMP-STING sig⁃nal pathway［37］

3 cGAS的生物学功能

cGAS-STING 途径在引发针对各种微生物病原体的有效免疫中的关键作用已被普遍证明［38-39］，此外研究报道证明cGAS 在自噬中也发挥作用，cGAS是可将错误定位的DNA 监测为危险相关分子模式（DAMP），并诱导Ⅰ型IFN 和其他细胞因子表达的传感器［6］，且胞质 DNA 传感途径已成为 DNA 损伤与先天免疫间的主要联系。现将主要论述cGAS 在自噬、DNA损伤、细胞衰老和癌症中的功能。

3.1 cGAS在自噬中的作用 自噬是一种溶酶体降解途径，对生存、分化、发育和体内平衡至关重要。自噬主要起适应性作用，以保护生物体免受各种病理学侵害，包括感染、癌症、神经变性和衰老等，且也有相关研究证明自噬在病毒免疫中发挥作用［40-41］。WATSON 等［42］在 2012 年首次报道细胞外结核分枝杆菌胞质DNA 触发了STING 依赖性微生物向自噬体的传递，证明胞质DNA 与自噬间存在联系，但其基本机制仍不明确。2014年LIANG 等［43］研究证明含 Mab-21 结构域的 cGAS（MB21D1/cGAS）与Beclin-1 自噬蛋白间具有直接的相互作用关系，说明细胞内DNA 传感途径与自噬机制间的相互作用，这种相互作用不仅抑制了MB21D1 的酶促活性以阻止cGAMP的产生，还增强了自噬介导的胞质微生物DNA 的降解，表明MB21D1是细胞内DNA 传感途径与自噬途径间的分子联系。LIANG 等［44］还证明cGAS 与Beclin-1 的结合是通过双链DNA 刺激或DNA 病毒感染引起的，二者的有效结合取决于cGAS 的 DNA 结合活性，且 cGAS 和 Beclin-1 间的交叉调控与cGAMP-STING 无关，是位于cGAMPSTING 的上游信号事件，说明STING 的表达对cGAS-Beclin-1 相互作用不是必需的。cGAS 和Be⁃clin-1 的相互作用使cGAS 竞争性结合Beclin-1 的中央结构域CCD，最终从Beclin-1自噬复合体释放Ru⁃bicon（PI3KC3 复合物亚基，自噬负调控因子），导致PI3KC3（磷脂酰肌醇3-激酶Ⅲ类）活性受到抑制，从而阻断了自噬的成熟步骤［45-46］，导致PI3KC3 激活并诱导自噬以去除胞质病原体DNA，在宿主免疫应答的后期，cGAS 可能在 STING 介导的 IFN 途径和 Be⁃clin-1 介导的自噬途径间穿梭，以引起IFN 产生，同时诱导自噬介导的DNA 降解以防止cGAS 过度激活和避免持续的免疫刺激。因此，cGAS 作为胞浆DNA 传感器协调干扰素和自噬途径，最终优化宿主抗微生物活性的时间和效率，以响应各种环境刺激和感染。

陈志坚团队发现STING 在结合cGAMP 后，含有STING 的内质网-高尔基体中间隔室（endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment，ERGIC）是LC3 脂质化的膜来源，蛋白质LC3 是自噬小体的关键标志物，通过LC3 脂质转移到正在生长的自噬小体上，这是自噬体发生的关键步骤［47］。同时该研究发现cGAMP 诱导的自噬对细胞质中DNA 和病毒的清除很重要。有趣的是，海葵中的STING 在cGAMP刺激下可诱导自噬，但不诱导干扰素表达，证明诱导自噬是cGAS-STING 通路的原始功能［48］。尽管细胞内DNA 传感途径和自噬途径间的分子联系在对病原体的平衡免疫防御中起至关重要的作用，但其相关机制有待进一步研究。

3.2 cGAS 在DNA 损伤的作用 正常情况下的所有哺乳动物中，DNA 紧密地包裹在细胞核内受到保护，不会自由移动，cGAS在细胞中处于休眠状态，当机体受到某些威胁时，如细胞的自身损伤或有入侵细胞的病毒或细菌时，DNA 片段“离开”细胞核，以微核的形式导致细胞质中的DNA 积累［49-51］。cGAS被募集到微核中，与DNA 损伤的标记物（例如磷酸化组蛋白）在微核中共定位，微核中的cGAS 可能被染色体DNA 激活以合成cGAMP，激活相应信号通路［52］。cGAS 对 DNA 损伤也并不仅局限于微核内，LIU 等［53］研究发现 cGAS 在 DNA 损伤后移位到核中，并与DNA 双链断裂的位置结合在一起，然而核cGAS 没有激活酶的催化和cGAMP 的产生，而是与DNA 损伤位点相关联，抑制了DNA 修复过程，该研究提出，抑制cGAS转运和将cGAS定位于DNA 双链断裂的方法是最小化DNA 损伤并增强DNA 修复的机制。cGAS 能够监测到细胞质DNA 并做出反应的原因就是核DNA损伤通过cGAS识别破裂的微核，将基因组不稳定性与先天性免疫反应联系在一起，但cGAS在DNA修复中的潜在作用仍然是未知的。

3.3 cGAS在细胞衰老中作用 细胞衰老是由各种不同的压力触发的，并以永久性细胞周期停滞为特征。衰老细胞分泌多种炎症因子，统称为衰老相关的分泌表型（senescence-associated secretory pheno⁃type，SASP），SASP 不仅充当衰老的标志，而且参与衰老过程。通过SASP 的自分泌和旁分泌作用，衰老细胞会严重影响许多生物学过程，包括伤口愈合、组织修复、肿瘤发生［54-56］。最近的研究证明cGAS 在促进细胞衰老中也具有重要作用［57］。GLUCK 等［58］研究发现cGAS的激活基于其对异常胞质染色质片段（CCFs）的识别，cGAS 激活后通过STING 触发SASP 因子的产生，从而促进旁分泌衰老，同时发现细胞衰老的各种触发因素包括氧化应激、致癌基因信号、辐射和促衰老药物等都参与cGAS-STING 途径来驱动炎症性SASP 成分的产生，cGAS 对胞质染色质片段的先天免疫感应可促进衰老。总之，这些发现通过cGAS-STING 途径建立了内源性DNA 监测，并作为衰老和SASP 的重要调节剂。YANG 等［59］发现 DNA 与细胞质中的 cGAS 结合，激活 cGAS 以应对 DNA 损伤，cGAS 不仅与细胞周期中细胞核染色质DNA 相关，也与细胞质中受损DNA 相关，这引起了一个可能性，即cGAS 可能通过STING依赖性机制调节细胞周期和衰老，但cGAS如何调节细胞周期和细胞衰老尚未明确，但依赖cGAS的SASP 基因表达可能有助于细胞衰老模型的建立，且cGAS 抑制剂可能对治疗和细胞衰老或年龄有关的疾病中有益。以上研究结果表明，cGAS 是DNA 损伤、SASP 基因表达和衰老间的重要分子联系［60-61］。

3.4 cGAS在肿瘤中的的作用 因为基因组的不稳定性，cGAS-STING 在肿瘤作用中有两面性，一方面是该途径有助于抗肿瘤免疫，是阻止恶性肿瘤的内在屏障，癌细胞固有的cGAS 对于通过先天性和适应性免疫控制肿瘤至关重要；另一方面，该途径可促进炎症驱动的癌变和转移［62］。

DNA 损伤通常发生于癌症早期阶段，其可触发cGAS-STING 途径诱导干扰素产生［63］。虽然长期激活cGAS-STING 具有致癌作用，但cGAS-STING 信号在免疫介导的恶性细胞清除中起重要作用，cGASSTING可作为候选药物靶标治疗癌症和其他疾病的自身 DNA 引起的炎症［64］。研究证明 DNA 双链断裂是细胞染色体复制过程中最严重的一种DNA 损伤，修复功能缺陷可能造成两种结果：一是细胞死亡；二是发生基因突变或进而恶性转化为肿瘤细胞［65］。然而已癌化细胞DNA修复能力增强，使用聚ADP核糖聚合酶1（PARP-1）抑制剂或者PARP-1 基因敲除能降低肿瘤细胞的DNA 修复功能，增强其对DNA损伤因子敏感性，同源重组缺陷细胞对PARP 抑制剂有较高的敏感性是具有临床研究意义一种DNA修复途径。研究证实cGAS 抑制小鼠和人类模型中的同源重组［53］，DNA 损伤以一种依赖于输入蛋白-α的方式，将cGAS 从细胞质转运到细胞核中的DNA双链断裂位点上，并通过聚腺苷二磷酸核糖与PARP-1 相互作用，抑制同源重组，此研究证明在体外和体内降低cGAS 基因表达会抑制DNA 损伤和肿瘤生长，因此认为细胞核中的cGAS 抑制同源重组介导的修复，并促进肿瘤生长，cGAS 代表癌症预防和治疗的一种潜在的靶标。越来越多的证据表明，cGAS-STING 途径至少对3 种主要的癌症疗法（放射疗法、化学疗法和免疫疗法）具有重要作用，是一种新希望的药物靶点。

4 小结与展望

现已公认cGAS 是微生物病原体的主要传感器，通过一系列的研究已经建立了该DNA 传感途径的基本框架和机制，但调控细节仍需进一步完善。新的研究阐明了cGAS 在监测DNA（在病理条件下错误定位到细胞质）中的重要作用，所有细胞和组织都含有可能引发炎症的“危险”DNA，因此cGAS途径可能在涉及炎症的许多常见疾病中起作用，将基因组不稳定性与天然免疫应答联系起来，为肿瘤的治疗提供新的策略，启发研究者利用该通路的激活剂提高抗肿瘤免疫，开发新一代肿瘤的免疫治疗法，调节cGAS 活性可能是治疗与衰老相关的人类疾病的新思路［66］。开发有效、特异性的cGAS 激动剂或抑制剂是未来科学研究的重要方向，且其不仅作为研究工具十分有用，作为治疗多种人类疾病的潜在治疗剂也具有很大价值。