白花香莲解毒颗粒促进慢性乙型肝炎HBeAg血清学转换及对血清Furin表达的临床研究

李旺，邱华，蒙荫杰，吕超，舒发明，李媛，毛德文

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001； 2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

抗病毒是慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)治疗的关键，根据病毒学与血清学的应答结果，可分为基础终点、满意终点及理想终点3个阶段。循证数据显示，对于HBeAg阳性的CHB而言，达到HBeAg血清转换预示着更低的复发率，更短的疗程及更少的经济负担[1]。而目前核苷(酸)类似物、干扰素等抗病毒药物在实现理想目标即HBsAg血清学转换、满意目标即HBeAg血清学转换方面均尚未取得预期疗效。因此，深入探索HBeAg血清学转换的分子机制，构建有效的干预新途径，提高血清学转换率是当前乙肝抗病毒领域国际最前沿方向及技术争夺的制高点。弗林蛋白酶(Furin)是一种重要的内切蛋白酶，属于前蛋白转化酶家族成员。研究发现，Furin通过对HBeAg前体的切割，参与到HBeAg的成熟过程[2]，而未切割的HBeAg可以被转运到细胞外膜上从而触发抗病毒免疫反应[3]。本课题组前期临床及体外实验均证实白花香莲解毒颗粒具有促进HBeAg和HBsAg血清学转换的疗效，但是其机制尚未明确[4]。本研究拟通过观察白花香莲解毒颗粒对HBeAg阳性CHB患者血清HBeAg及Furin表达的影响，以揭示其促进HBeAg血清学转换的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

在2018年7月—2019年6月期间，收集120例在广西中医药大学第一附属医院肝病科就诊的HBeAg阳性CHB患者和20例健康人。将120例HBeAg阳性CHB患者随机分为对照组和治疗组，各60例。其中对照组男性33例，女性27例，平均年龄(33.24±10.78)岁，HBV DNA载量(6.62±0.63)lg IU/mL，血清中HBeAg滴度(884.76±479.52)S/Co；治疗组男性36例，女性24例，平均年龄(35.42±9.88)岁，HBV DNA载量(6.43±0.89)lg IU/mL，血清中HBeAg滴度(926.76±513.18)S/Co。两组患者性别、平均年龄、HBV DNA载量、HBeAg滴度等基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。同时招募20例健康人作为健康对照组，其中男、女人数各10例，平均年龄(30.15±4.38)岁。该研究通过广西中医药大学第一附属医院伦理委员会的审批，且参与研究的所有受试者都签订了知情同意书。

1.2 诊断标准

HBeAg阳性CHB诊断标准：参照《慢性乙型肝炎防治指南(2015)》[5]中的诊断标准,血清HBsAg、HBeAg均为阳性，HBV DNA阳性，ALT持续或反复异常或肝组织学检查有炎症变化。

1.3 纳入及排除标准

纳入标准：①符合HBeAg阳性CHB诊断标准[5]；②HBV DNA≥2×105，ALT≥2×ULN；③年龄18～65岁；④签署知情同意书。

排除标准：①合并其他肝炎病毒，如甲、丙、丁、戊型肝炎；②有艾滋病、肺结核及梅毒等严重传染病者；③合并肝细胞癌、肝性脑病及其他严重的全身性疾病和精神病患者；④孕妇或哺乳期妇女；⑤对中药过敏者。

1.4 治疗方法

对照组：给予恩替卡韦分散片(规格型号：0.5 mg×28片，正大天晴药业集团股份有限公司，批准文号：国药准字H20100019)0.5 mg/次，1次/d，定时空腹口服(餐前或餐后至少2 h)，疗程48周。

治疗组：在对照组的基础上加白花香莲解毒颗粒[6],主要成分为白花蛇舌草30 g，三叶香茶菜20 g，黄花倒水莲15 g，排钱草15 g，14 g/袋，由广西中医药大学第一附属医院院内制剂中心统一制备,1袋/次，2次/d，早晚饭后冲服，疗程48周。

1.5 观察指标及检测方法

血清中Furin、HBeAg的测定：清晨空腹抽取静脉血5 mL于真空采血管中，将试管样本放置4 ℃ 3 000 r/min离心20 min，仔细取上清液，将血清样品储存在-80 ℃冰箱。使用酶联免疫吸附法测定血清中Furin、HBeAg水平，结果均以pg/mL表示。检测过程严格按照试剂盒说明书进行，质控均在范围内。HBV DNA载量的测定：采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA载量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 治疗前后各组DNA HBV载量的比较，见表1。

表1 治疗前后两组CHB患者HBV DNA载量的比较

治疗前，两组患者血清中HBV DNA载量对比，差异无统计学意义(P>0.05)；在12周、24周、48周，两组患者血清中HBV DNA载量较前均低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。两组同时间段比较：治疗12、24周后，治疗组HBV DNA载量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，治疗48周后，两组HBV DNA载量相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 两组HBeAg血清学转换比率和HBeAg转阴比率的比较

治疗48周，治疗组HBeAg血清学转换和HBeAg转阴率明显高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组CHB患者HBeA血清转换比率和HBeAg转阴比率的比较[例(%)]

2.3 两组HBeAg滴度水平的比较

治疗12周、24周、48周，治疗组的HBeAg滴度显著低于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 两组CHB患者HBeAg滴度水平的比较

2.4 治疗前后各组血清中Furin含量的比较

治疗前，两组患者血清中Furin含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，两组患者与健康对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组在治疗12、24、48周时，Furin的含量均低于治疗前，且在24周、48周，治疗组Furin含量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组在治疗24周、48周后，血清中Furin含量与治疗前相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 治疗前后各组血清中Furin含量

2.5 不良反应记录

治疗前后，两组患者的血常规、肾功能及心电图均未见明显改变，治疗组出现1例腹泻症状，予蒙石脱散后，症状缓解，之后未出现严重不良事件。

3 讨论

临床上CHB患者，根据HBeAg阳性和阴性表达不同可分为HBeAg阳性CHB、HBeAg阴性CHB，前者由野生型毒株引起发病，占CHB患者人群的大部分。研究表明，HBeAg阳性代表着HBV病毒复制活跃，进展为肝硬化、肝衰竭及肝癌等重症肝病的风险更大[7]。而HBeAg血清学转换(HBeAg Conversion，HC)，即血清中HBeAg消失，同时出现能够识别HBeAg的T细胞依赖性中和抗体(e抗体)，其后期因HBV相关的肝衰竭、肝硬化和HCC发生率明显减少，且停药后出现病毒学、生化学和组织学突破者显著下降，被认为是抗病毒过程中的标志性转折点。目前抗病毒药有核苷(酸)类似物和干扰素，它们在抑制HBV DNA复制等方面已经取得较好的疗效，但是在促进HBeAg血清学转换这一更具临床价值、更迫在眉睫的问题尚不够理想。如恩替卡韦其治疗48周HBeAg血清学转换率仅为21%，3年为24%；替诺福韦治疗48周HBeAg血清学转换率为21%，替比夫定治疗48周其HBeAg血清转化率为25%～28%，3年可达42%。即使聚乙二醇干扰素也只能使30%～40%的HBeAg阳性CHB患者发生HBeAg血清学转换[8]。从上述数据不难看出，要实现大部分乙肝患者抗病毒治疗均能达到满意目标及理想目标仍然任重而道远。因此，深入探索HBeAg血清学转换的分子机制，构建有效的干预新途径，提高血清学转换率是当前乙肝抗病毒领域国际最前沿方向及技术争夺的制高点。其中Furin作为真核生物细胞中一种重要的内切蛋白酶，其通过识别特定的氨基酸序列，特异性切割前蛋白中成对的碱性氨基酸，使前体蛋白获得生物活性，对维持细胞内环境稳定和诱发多种疾病均起重要的作用[9]。Furin对HBeAg前体成熟为HBeAg发挥至关重要作用。HBeAg前体在经过高尔基体时，需被人蛋白酶Furin切去氨基端的34个氨基酸残基才能产生成熟的HBeAg蛋白，分泌到细胞外，进而诱导免疫耐受而参与慢性HBV感染状态的形成和维持[10]，YANG[11]等研究表明恩替卡韦联合Furin蛋白抑制剂能显著地减少HBV复制和HBeAg生成，这结论进一步证实下调Furin蛋白的表达会减少HBeAg的生成，有利于促进HBeAg血清学转换。以Furin蛋白为靶点的促HBeAg血清学转换研究日益受到关注。

中医药是治疗CHB的一种重要手段，其在保肝降酶、抗肝纤维化、调节免疫及抗病毒等方面具有较好的疗效。我国“十一五”“十二五”多项科技重大传染病专项从循证医学层面证实，中医药确能提高HBeAg阳性慢性乙型肝炎或携带者的HBeAg血清学转换率，这为破解目前HBV抗病毒治疗低HBeAg、HBsAg血清学转换率的难题提供了一种切实可行的新途径。有学者[12]研究表明中药联合阿德福韦治疗HBeAg阳性CHB患者48 W时，HBeAg应答率为29.64%，对照组为17.86%，提高HBeAg应答率11.78%，差异具有统计学意义(P<0.05)；还有研究[13]表明补肾健脾方治疗HBeAg阳性HBV携带者52 W时，治疗组患者HBeAg均值、HBsAg均值下降均显著优于安慰剂对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

白花香莲解毒颗粒[14]是在壮医“阴阳为本，三气同步”天人自然观、“谷道水道气道、龙路火路，三道两路通调”生理病理观和“虚毒致百病”病因病机观等核心理论指导下形成的。当机体正气虚(出现慢性乙型肝炎)，毒邪外侵，藏于咪叠(肝脏)，疏泄失司，蕴生诸毒，嘘勒(气血)瘀滞，致“三道”“两路”阻塞，使“三气”(天气、地气、人气)不能同步，共而为病的病机理论。白花香莲解毒颗粒是本课题组研制的治疗慢性乙型肝炎的有效药物。前期临床研究表明，白花香莲解毒颗粒联合阿德福韦酯胶囊治疗HBeAg阳性CHB患者，能显著提高了HBV DNA 转阴率、生化应答率及HBeAg血清学转换率[15-16]。

本研究结果显示，治疗12、24、48周时，两组患者血清HBV DNA载量均较治疗前显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。其中治疗12、24周，对照组血清中HBV DNA载量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗48周，对照组HBeAg血清学转换和HBeAg转阴率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗24、48周，对照组血清Furin表达量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，白花香莲解毒颗粒联合恩替卡韦的方案，能显著提高达到满意终点的HBeAg血清学转换率，其机制可能与下调Furin表达有关，具有一定的临床推广应用价值。