告达庭抑制卵巢癌生长及其机制的研究

龚建明 林 琪

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，病死率占各类妇科肿瘤的首位，由于缺乏有效的早期诊断方法，卵巢癌患者确诊时约2/3已为晚期。现临床上出现耐药的患者日益增多，且化疗药不良反应较多，对于晚期卵巢癌患者难以取得满意的疗效。

告达庭是一类传统中药具有悠久历史，现已被证明具有较强的抗肿瘤活性，其对宫颈癌、肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤均有较明显的抑制作用，其可通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制血管内皮生长因子的表达抑制肿瘤的生长与扩散[1，2]。但其具体作用机制尚不明确。本实验探讨告达庭对卵巢癌增殖凋亡的影响及其作用机制，为告达庭应用于临床治疗卵巢癌提供实验基础。

材料与方法

1.材料：人卵巢癌细胞株SKOV3购自中科院上海细胞库。告达庭标准品(纯度大于98%)购自深圳美荷生物科技有限公司；CCK-8试剂盒、检测凋亡ELISA试剂盒购自美国Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640、核蛋白提取试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司；DNMT1、Axin、Bcl-2、cyclinD1抗体购自美国Sigma公司；反转录试剂盒、定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

2.细胞培养及分组：用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置37℃、5%的CO2、相对饱和湿度下培养。细胞实验分为两组，即对照组(未予药物干预)和告达庭组(30μmol/L告达庭作用SKOV3细胞24h)。

3.CCK-8法检测细胞增殖：收集处于对数生长期的SKOV3细胞，制成单细胞悬液，接种到96孔板，各孔细胞均匀，每孔细胞数约5×103，过夜贴壁后，分别加入不同浓度告达庭(7.5、15、30、60μmol/L)，每组3孔，置37℃培养箱作用24h，同时设置空白调零组(不加细胞加入等量的培养液)，以及对照组(加等量的0.9%氯化钠溶液)，药物作用结束前1h，各孔加入CCK-8溶液10μl，继续培养1h，酶标仪测A450值，细胞活力=(实验组A450值-空白调零组A450值)/(对照组A450值-空白调零组A450值)×100%。

4.ELISA法检测细胞凋亡：各组细胞离心后，用200μl溶细胞缓冲液重新悬浮，作用30min。取上述样品，1200r/min离心10min后，吸取20μl上清液，加入培养板孔中。另加入80μl免疫反应试剂，置摇床上孵育2h。取上清，加入100μl底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合。尽快做比色分析，用底物缓冲液作空白对照，以检测波长405nm，参考波长492nm进行检测。

5.Western blot法检测卵巢癌SKOV3细胞内蛋白的表达：收集各组细胞，加入含有PMSF的细胞裂解液，提取上清液为细胞总蛋白。按试剂盒说明书提取细胞质蛋白、细胞核蛋白。测定蛋白浓度后取等量蛋白质样品上样，于12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳2h，转膜，用10%脱脂奶粉封闭后加入一抗，4℃过夜，再度洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，ECL显色，X线胶片曝光，用软件Quantity One分析条带灰度值。

6.实时荧光定量PCR：引物由TaKaRa公司设计合成。取移植瘤标本组织，按试剂盒说明书提取组织总RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA。反应条件：预变性93℃ 20s，变性92℃ 18s，退火58℃ 26s，延伸70℃ 15s，共43个循环。实时PCR结果以达到阈值的最低循环数Ct值表示。目的基因的相对表达量fold=2-△△Ct。△△Ct表示告达庭组和对照组间的△Ct值差异。引物序列详见表1。

7.裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的建立：选择8～10周龄雌性BALB/c裸鼠，体质量18～20g，将3×106个SKOV3细胞悬浮于0.2ml培养基中，注射到裸鼠腋下皮肤内建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，接种2周后，待移植瘤直径长至约10mm。再将这些裸鼠随机分为对照组、告达庭小、中、大剂量组，每组8只。对照组：灌胃予0.9%氯化钠溶液1毫升/只；小剂量组：灌胃予告达庭10mg/kg；中剂量组：灌胃予告达庭20mg/kg；大剂量组：灌胃予告达庭40mg/kg。隔日给药1次，共2周。第8周处死裸鼠留取皮下移植瘤组织。

结 果

1.告达庭对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响:卵巢癌SKOV3细胞经不同浓度告达庭(7.5、15、30、60μmol/L)作用24h后，细胞存活率分别为91.73%±4.67%、83.12%±7.56%、59.48%±5.37%、41.63%±3.48%。与对照组100.00%±0比较，均明显下调(P均<0.01)。告达庭可抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖，呈浓度依赖性，IC50为38μmol/L，故选30μmol/L作为本实验的基本药物浓度，选15、60μmol/L为小剂量、大剂量药物浓度。

2.告达庭对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响：不同浓度告达庭(15、30、60μmol/L)作用SKOV3细胞24h后，分别诱导9.35%±0.71%、14.37%±0.96%和18.54%±1.02%的SKOV3细胞凋亡，与对照组5.51%±0.38%比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3.告达庭对卵巢癌SKOV3细胞内Bcl-2、CyclinD1蛋白表达的影响：与对照组比较，告达庭组Bcl-2、CyclinD1蛋白的表达均下调，差异有统计学意义(P<0.05)，表明告达庭可抑制SKOV3细胞内Bcl-2、CyclinD1蛋白的表达(图1)。

图1 告达庭对卵巢癌SKOV3细胞内Bcl-2、CyclinD1蛋白表达的影响1.对照组；2.告达庭组

4.告达庭对卵巢癌SKOV3细胞内DNMT1、Axin、Nuclear β-catenin蛋白表达的影响:与对照组比较，告达庭组DNMT1、Nuclear β-catenin蛋白的表达均下降，Axin蛋白表达上调，差异均有统计学意义(P<0.05,图2)。

图2 告达庭对卵巢癌SKOV3细胞内DNMT1、Axin、Nuclear β-catenin蛋白表达的影响1.对照组；2.告达庭组

5.告达庭对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长的抑制作用：与对照组比较，告达庭组小剂量组、中剂量组、大剂量组瘤重均减轻，差异均有统计学意义(P<0.05)。告达庭大剂量组与中剂量组、小剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)，中剂量组与小剂量组比较差异亦有统计学意义(P<0.05,表2)。

表2 告达庭对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长的抑制作用

6.告达庭对裸鼠肿瘤组织中DNMT1、Axin、Bcl-2和cyclinD1 mRNA表达的影响:与对照组比较，告达庭组裸鼠肿瘤组织内DNMT1、Bcl-2和cyclinD1 mRNA表达均下降，Axin mRNA表达升高(表3)。

表3 告达庭对裸鼠肿瘤组织中DNMT1、Axin、Bcl-2和cyclinD1 mRNA表达的影响

讨 论

白首乌是具有强筋骨、黑发、补肝肾及延年益寿等功效的传统补益中药，现代研究发现白首乌具有抗肿瘤、抗衰老、增强免疫等药理活性。告达庭是从白首乌中提取纯化的一种C-21甾体苷元，体外研究表明告达庭对人胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤均有明显抑制作用。

本实验证明，与对照组比较，告达庭组卵巢癌SKOV3细胞增殖率均明显下调，而凋亡率升高，且呈剂量依赖性；在裸鼠移植瘤实验中，亦观察到告达庭抑制卵巢癌移植瘤的生长。细胞及动物实验均表明告达庭能抑制卵巢癌生长。已有相关的研究报道，告知庭的抗肿瘤机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。本实验进一步研究显示告达庭抗卵巢癌机制可能与此通路相关。

Wnt/β-catenin信号通路可调控细胞分化、增殖和凋亡等生理过程，与多种肿瘤的发生、发展密切相关[3]。细胞质中β-catenin转录到核内与TCF/LEF结合而激活下游靶基因(CyclinD1、Bcl-2、MMP-7、c-myc等癌基因)的转录，促进细胞增殖，癌变[4]。近年来发现许多抗癌研究以β-catenin为靶点[5，6]。本实验证明告达庭可抑制Nuclear β-catenin表达。本实验接下来阐述告达庭对β-catenin下游靶基因的影响，及下调β-catenin表达可能机制。

CyclinD1蛋白为原癌基因是细胞周期蛋白家族中的重要成员。CyclinD1通过与细胞周期依赖激酶形成复合物，在细胞周期的G1早期起重要调控作用。CyclinD1在丝裂原刺激下持续表达，促进细胞增生，与细胞癌变及转移密切相关。有研究显示，与正常及良性肿瘤组织比较，卵巢癌组织中CyclinD1阳性表达率高，并随卵巢癌恶性程度升高而表达增加[7]。

Bcl-2基因是从B细胞滤泡性淋巴瘤染色体断裂点发现的凋亡抑制基因，可抑制多种组织细胞的凋亡。Bcl-2在宫颈、乳腺、卵巢等肿瘤组织中均有不同程度的表达，且与肿瘤的发生、发展及预后有关。有研究表明，在良性卵巢肿物中Bcl-2的表达低于交界性、恶性肿瘤，且Bcl-2过表达与肿瘤转移、进展密切相关[8]。

本实验证明，在细胞实验中与对照组比较，告达庭组CyclinD1、Bcl-2蛋白表达均下降；在体外移植瘤实验也发现告达庭组CyclinD1、Bcl-2 mRNA表达亦下调，且CyclinD1、Bcl-2与卵巢癌的发生、发展密切相关。表明告达庭可通过抑制CyclinD1、Bcl-2在卵巢癌细胞及组织中表达，促进卵巢癌细胞凋亡，发挥抗癌作用。

DNMT1是DNA甲基转移酶家族重要成员。DNMT1是可调节DNA甲基化，与肿瘤的发生、发展也有密切关系。抑癌基因的甲基化会引起抑癌基因失活，使其对肿瘤的抑制丧失，促进癌细胞增殖。原癌基因的低甲基化会使癌细胞不断增殖形成肿瘤[9，10]。相关的研究显示，与正常卵巢组织比较，DNMT1在卵巢癌组织中的阳性率明显升高，且分期越晚、病理分级越高，DNMT1阳性率越高[11]。

Axin又称轴蛋白，其基因定位于第16条染色体的长臂上。Axin 作为一种抑癌基因，影响着肿瘤的发生和发展。卵巢癌组织中Axin阳性表达率明显低于卵巢良性肿瘤，且与卵巢癌组织的转移和浸润有一定的相关性[12，13]。

Axin 是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成部分，作为 Wnt 信号通路的抑制因子而被广泛研究。在Wnt/β-catenin信号途径中，胞质中的β-catenin与APC、Axin等降解复合物结合，进一步被泛素化降解。当Axin蛋白表达异常，β-catenin降解被阻断，导致其在胞质蓄积进入核内，促进下游癌基因CyclinD1、Bcl-2表达[14]。另有文献报道DNMT1可通过甲基化Axin基因，使Axin蛋白失活，减少β-catenin降解，促进β-catenin核转入，促进癌细胞生长[15]。

本实验结果表明，与对照组比较，告达庭组DNMT1、Nuclear β-catenin蛋白表达均下降，Axin蛋白表达上升。表明告达庭可抑制DNMT1、Nuclear β-catenin蛋白表达，而上调Axin蛋白。其机制可能是告达庭抑制DNMT1表达后，Axin蛋白甲基化减少，Axin蛋白表达增加，促进β-catenin降解，减少β-catenin核转入，进而降低下游癌基因CyclinD1、Bcl-2表达。

综上所述，告达庭可能通过抑制DNMT1，减少DNA甲基化，上调Axin蛋白，进而减少β-catenin核转入，抑制下游癌基因表达，促进卵巢癌细胞凋亡。本研究为告达庭应用于临床治疗提供实验基础，但告达庭具体的作用机制还需开展深入研究。