饲料氨基酸的不同检测方法在饲料生产中的比较研究

魏姜勉

（黄淮学院生物与食品工程学院，河南驻马店 463000）

随着我国居民生活水平的不断提升，人们对动物蛋白质的需求量不断增加。动物是人类食品中优质蛋白质的重要来源，发展畜牧养殖是一种快速提高畜禽类蛋白质产量的重要科学手段（张浩然等，2021）。畜牧业的发展与饲料中蛋白质的含量息息相关，饲料蛋白质将会转化为动物蛋白质，从而提高畜禽生长速率，促进饲料蛋白质研究。蛋白质是动物饲料中的核心营养成分，蛋白质维持动物机体组织更新和生命代谢活动，是动物组织细胞膜的重要组成物质。因而，蛋白质含量是衡量动物饲料质量的重要指标，成为养殖户的关注焦点（贺习文等，2021）。由于饲料中蛋白质是由氨基酸组成，蛋白质的营养代谢是以氨基酸代谢为主，氨基酸平衡是动物代谢的关键点。

随着动物饲料质量和安全性不断提高，确定饲料中蛋白质和氨基酸的合理配比，便于提高饲料蛋白质的利用率。饲料中氨基酸比例和种类是衡量饲料质量的重要参数（石长波等，2021；辛娜等，2021；谢伟，2021）。饲料中氨基酸平衡会提高动物对氨基酸的利用率，提高动物生长速率，进而节约饲料资源。因此，饲料中氨基酸的结构和组成是配制混合饲料的重要指标，而快速、准确测定动物饲料中氨基酸含量已成为饲料研究热点。鱼粉中氨基酸比例极佳，与其他动物氨基酸比例相似，饲料安全性好，便于消化，是重要的动物蛋白质来源，而豆粕是植物蛋白质原料的代表，且抗营养因子含量少，植物蛋白质含量丰富，来源丰富，易于获得，已成为理想的植物蛋白质来源（谢伟，2021；孙播东等，2021；宋洁；2021）。因此，本研究选用鱼粉和豆粕作为动物饲料氨基酸的测定对象。饲料中含有的氨基酸比例和含量是检测饲料质量高低的重要指标。目前，氨基酸的测定方法为常规化学分析、色谱分析和光谱分析等，利用盐酸水解法测定氨基酸，该方法适用性强，易于蒸发，方便操作。本研究使用近红外光谱仪对饲料样品中氨基酸的含量进行光谱扫描，准确测定各种氨基酸的含量和常规成分分析，节约人力资源，对氨基酸进行湿化学分析的数据作为基础模型，对扫描样品与湿化学分析结果对比，验证样品模型的准确性。本研究对氨基酸种类的处理方法和液相色谱仪分离进行优化，建立简便、准确的紫外检测分析氨基酸方法，该方法分析速率快，灵敏度高，为分析饲料中氨基酸种类和含量提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 饲料样品（大豆，豆粕，鱼粉和混合饲料）

1.2 试验试剂 甲醇、氯化钠、苯酚、双氧水、甲酸、抗坏血酸、硝酸银、茚三酮、乙二酸甲醚、2，4-二硝基氯苯、乙氰、碳酸氢钠、乙酸钠、冰乙酸、氢氧化锂、苯酚、盐酸、氢氧化钠、低速离心机及乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

1.3 试验设备 氨基酸分析仪、剪刀、镊子、饲料粉碎机、天平、恒温箱、涡旋仪、浓缩仪和温度控制仪、高效液相色谱仪、C18色谱柱、电子天平、电热鼓风干燥箱、pH酸度计、万用电炉、超声波清洗仪、电热加热炉、水浴锅以及真空抽水泵等。

1.4.1 饲料样品的预处理 将饲料样品放入饲料粉碎机进行粉碎，将其放入分析筛（40目），称取0.2 g样品放入安培瓶中，加入氢氧化锂20 mL，马上接入氮气，放入高温水浴锅中加热到110℃水解，待其冷却后将水解液放入100 mL容量瓶中加入乙酸钠缓冲溶液定容，加入少量盐酸进行中和，调节液体pH，定容和摇匀，取25 mL溶液放入低速离心机中离心30 min，取试管中的上清液，取上清液过滤有机膜（0.45 um），放入高效液相色谱仪检测。

1.4.2 饲料标准样品的配置 称量0.1 g（0.0001g）饲料中常见的 20种氨基酸标准样品，放置于250 mL容量瓶中，使用0.1 mol/L盐酸定容，混匀，得到1000 mg/L的20种氨基酸混合标准液体，放入4℃冰箱中保存备用。将原溶液1000 mg/L 稀 释 为 750、600、550、450、350、250、150、50和25mg/L的氨基酸混合标准溶液，放入4℃冰箱中备存。

1.4.3 饲料样品曲线的制备 移取100 uL的750、600、550、450、350、250、150、50 和 25 mg/L的20种氨基酸的混合标准溶液放入有机膜进行过滤，进样量为10 uL，使用相关软件进行检测。以20种氨基酸的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制饲料样品氨基酸的标准曲线。

1.4.4 高效色谱调节条件 高效液相色谱仪的调节条件为C18色谱柱，流动相A为甲醇；B流动相为乙酸-乙酸缓冲液，流动相为1mol/min；进样品量为10 uL，柱温度为32℃，紫外线波长为280 nm，等度洗脱，A流动相：B流动相为=1：9。

1.5 微波水解-氨基酸分析方法 称取一定量的饲料样品，将其溶解于水中，加入1 mol/L的盐酸溶液4.8 mL，当饲料样品全部湿润后冲入定量的氮气，固定瓶盖，放入微波仪中，连接温度传感器，按照设定程序进行操作，等待罐内温度降低到50℃取出水解液体，放入250 mL容量瓶中定容和过滤，将样品放入氨基酸分析仪器中测定。

1.6 近红外分析光谱法

1.6.1 饲料样品预处理 本实验样品均使用饲料粉碎仪进行破碎，然后进行混匀，放入4℃冰箱保存备用。鱼粉样品脱脂处理，然后烘干，再进行粉碎。

1.6.2 样品氨基酸测定 将饲料样品加入蛋白质裂解液后，制定标准氨基酸溶液和测定样品氨基酸溶液，放入氨基酸分析仪中测定，采用梯度洗脱方式来洗脱氨基酸组成，组间加入氨基酸标准溶液校正，对氨基酸样品进行定量测定，对所有样品的氨基酸进行湿化学测定。

为进一步比较两种快速检测方法相对于原吸法检测结果的一致性，明确两种快速检测方法各自的优越性与局限性，本研究对三种方法针对同一批稻谷样本的检测结果进行了统计学上的初步分析，计算了三种方法之间的差异程度与相关性水平，探讨了两种快速检测方法的实际应用效果与使用范围，以期对粮食收储先检后收工作提供帮助。

1.6.3 样品模型建立 采用Win ISI III光谱分析软件和OPUS软件对19种氨基酸的化学测定值进行相关联性分析，建立豆粕和鱼粉等饲料氨基酸和常规指标含量分析预测模型。

1.6.4 检验样品的准确性 采用近红外光谱分析仪扫描验证样品进行预测数据，与之前的数据进行对比，采用T检验预测模型的正确性。

2 结果与分析

2.1 饲料氨基酸不同测定方法的水解条件对比分析 为了确定不同测量方法对饲料氨基酸水解时间的影响，选用鱼粉和豆粕等试验样品进行预试验，饲料样品氨基酸水解方法按照不同测定方法条件设定的参数进行实验，对比结果如表1所示。微波水解处理饲料氨基酸样品的温度为165℃，处理时间为25 min，饲料样品中水解氨基酸的值均超过标准水解条件氨基酸的值，高效液相色谱法水解饲料氨基酸样品的温度为150℃，水解时间为20 min，饲料中水解氨基酸的值接近标准条件的氨基酸值；近外光谱分析法水解饲料氨基酸的温度为180℃，处理时间为28 min，饲料样品中水解氨基酸的值远超过标准水解条件的氨基酸值；通过对比实验饲料氨基酸处理效果，高效液相色谱法水解氨基酸的时间最短，处理温度最低，实验效果最佳。

表1 不同分析方法处理样品氨基酸的对比分析

2.2 不同测定方法的水解盐酸浓度饲料氨基酸峰面积的对比分析 将饲料样品加入不同浓度梯度的盐酸溶液（3、5、7、9、11mol/L）中，放入水浴锅中水解后，取上清液过滤后放入氨基酸分析或高效液相色谱仪中测定氨基酸种类，以峰面积大小为指标，确定最佳的盐酸浓度。

在不同测定方法的饲料氨基酸样品中分别加入不同浓度梯度的盐酸，并测定氨基酸峰面积结果，分析结果如下图1～3所示。试验结果表明，盐酸溶液浓度从3 mol/L增加到7 mol/L时，随着盐酸浓度的增加，氨基酸的峰面积呈现递增趋势，其原因为盐酸浓度太低，氨基酸没有完全水解，当浓度为7 mol/L时，氨基酸的峰面积最大，当浓度从7 mol/L增加到11 mol/L时，氨基酸的峰面积呈现下降趋势，主要原因是盐酸浓度较高，氨基酸结构被破坏。通过对氨基酸峰面积的对比分析：高效液相色谱法的氨基酸峰面积较大，测定结果较好，而近外光谱分析法中氨基酸的峰面积较小，结果值较少。

图1 微波水解-氨基酸自动分析法的不同盐酸浓度测定的氨基酸面积

图2 高效液相色谱法的不同浓度盐酸测定的氨基酸面积

图3 近红外光谱分析法的不同浓度盐酸测定的氨基酸面积

2.3 不同分析方法对饲料氨基酸测定结果的影响 由表2可知，高效液相色谱测定饲料中氨基酸的组成与标准成分结果相似，各类氨基酸相似程度偏差范围为0.01%～0.2%；微波处理方法测定饲料中氨基酸的组成与标准成分结果相差较大，各类氨基酸相似偏差范围为2.34%～6.34%；近外光谱法测定饲料氨基酸的组成与标准测定结果相差较小，偏差程度范围为0.24%～0.98%；通过结果对比分析：高效液相色谱法测定饲料氨基酸的结果与标准测定结果相似，结果偏差程度较小。

表2 不同分析方法对饲料氨基酸的组成影响

2.4 不同分析方法对饲料氨基酸稳定性分析 由表3可知，高效液相色谱测定饲料中氨基酸稳定性与标准成分结果相似，各类氨基酸相似程度偏差范围为0.01%～0.16%；微波处理方法测定饲料中氨基酸的稳定性与标准成分结果相差较大，各类氨基酸相似偏差范围为1.51%～4.55%；近外光谱法测定饲料氨基酸的稳定性与标准测定结果相差较小，偏差程度范围为0.24%～0.68%；对结果进行对比分析发现，高效液相色谱法测定饲料氨基酸的稳定性结果与标准测定结果相似，稳定性较强。

表3 不同分析方法对饲料氨基酸稳定性的影响

2.5 不同分析方法对不同饲料氨基酸总量测定结果比较分析 由表4可知，高效液相色谱法的测定结果与标准测定结果类似，变异系数与标准差最小，而微波水解处理方法测定其饲料氨基酸的总量高于饲料的标准测定含量，变异系数和标准差较大，而近外光谱分析法对饲料氨基酸总量分析影响程度较小，标准差在0.13～0.26之间，综合比较发现，3种检测方法已达到检测标准，满足饲料氨基酸检测要求。

表4 不同分析方法对不同饲料氨基酸总量测定结果比较分析

3 讨论

3.1 饲料氨基酸中不同分析方法的优劣势对比分析 本研究饲料样品采用微波水解法进行氨基酸测定。并确定微波水解条件为165℃，加热25 min，该方式操作简单，缩短水解时间，提高饲料氨基酸的水解效率。饲料氨基酸的水解时间从原来20 h缩减为1 h，宋洁等（2021）对饲料蛋白质烘箱加热160℃进行水解，水解时间为2 h；任晓宇等（2017）对饲料原料用加热器进行水解，加热温度为160℃，水解时间为50 min，这些结果证明，微波水解方法正确，160℃是氨基酸水解的合适温度，能广泛应用于饲料氨基酸的检测。微波是一种300MHz的电磁波，能被水和食品广泛吸收，因而有机物能吸收电磁波能量而达到加热效果，大大提高了反应物的加热效率，缩减加热时间。水分子吸收微波能量效率极高，能快速完成饲料水解过程，提高饲料检测效率，操作简单、节约能耗、安全环保、成本较低，且利用效率高。

本研究采用近红外光谱分析法对饲料氨基酸样品进行分析，确定水解条件为175℃，加热时间为28 min，应用近红外光谱分析技术对豆粕和鱼粉等氨基酸含量建立预测模型，结果表明，近外光谱分析技术的基础模型比较稳定，对饲料氨基酸含量预测准确，检测时间快速。近红外光谱分析技术是一种新型测定技术，可利用化学数据库建立相关模型，可快速、准确地预测饲料氨基酸含量。石长波等（2021）对食品检测采用近红外光谱分析方法，结果表明，近红外光谱法可有效检测食品质量。谢伟等（2021）研究近红外光谱分析技术在化工上的应用分析，它能快速检测结果，效率高，精准度高，时效高，测试度数方便，检测效果精准（程传民等，2020；张元可等，2019）。这些结果表明，近红外光谱分析法有效应用于饲料氨基酸的检测。

本研究采用高效色谱法对饲料氨基酸含量的测定，本方法水解温度为160℃，时间为20 min，与前2种方法对比发现，该方法能有效缩短水解时间，提高水解效率，操作方便，检测效率高，节约能量，降低工作强度，提高工作效率。因此，本研究采用高效液相色谱法对氨基酸的检测效果更好。孙播东等（2021）发现，高效液相色谱法能精准测定饲料中尼卡巴嗪含量，与本研究结果类似。本研究对色谱柱、流动相及波长进行设定，建立氨基酸液相色谱法，且其氨基酸的测定含量在误差范围内，精密度较高，说明该方法的灵敏度、精准度较高，能对饲料氨基酸进行定量分析。

3.2 不同分析方法对饲料氨基酸测定的影响因素分析 本研究结果发现，不同浓度的盐酸对氨基酸峰面积有较大影响，盐酸浓度过高，氨基酸峰面积下降，其原因可能是氨基酸被破坏；盐酸浓度过低，氨基酸峰面积较小，其原因是氨基酸没有被完全水解，使用高效液相光谱分析法测定氨基酸含量，向其样品中加入不同浓度的盐酸，氨基酸峰面积较高，这说明该方法测定效率高，而近红外光谱分析法中加入不同浓度氨基酸样品，氨基酸峰面积较小，说明饲料中氨基酸的含量测定与不同测定方法有关，也可能与样品纯度有关。

本研究不同分析方法对饲料氨基酸组成与稳定性进行分析发现，高效液相色谱法对饲料氨基酸组成与稳定性的分析精准度较高，其结果与标准结果类似，偏差程度较小，而另外2种测定方法中饲料氨基酸的组成和稳定性与标准结果误差较大，偏差程度较大，但都在误差范围内，这表明高效液相色谱法的精准度较高，在一定程度上反映出饲料氨基酸含量。因此，对饲料样品中进行抽查氨基酸含量时，应根据实际情况采用不同的分析方法。

目前，分析饲料中氨基酸的不同检测方法发现，高效液相色谱法的测定结果较为精准，但其也存在一定缺陷，如携带不方便、建立标准模型耗时；但近红外光谱法的模型建立不太精准，测定水平参差不齐。因而，对饲料样品中氨基酸含量的检测应根据实际情况采用相应方法进行测定。

4 结论

本研究对微波水解法、近红外光谱分析法和高效液相色谱法的优劣势进行分析，结果发现，高效液相色谱法操作方便，检测精准度高，检测效率高，适用于饲料氨基酸含量的批量检测。