灵芝多糖功能饮料的研发及体外抗氧化活性分析

周春晖，唐 璐，范 瑞，阳元娥

（1. 广东轻工职业技术学院食品生物与技术学院，广东 广州 510300；2. 华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641）

灵芝（Ganoderma lucidum）又称瑞草、神芝，中医药认为是一种延年益寿，具有良好保健效果的药用真菌。经现代医学研究证实，灵芝中含有灵芝多糖、萜类化合物、氨基酸、有机锗等多种有益于人体健康的天然成分，利用价值极高[1-2]。其中，灵芝多糖作为灵芝的主要次生代谢产物，具有优良的药用和保健价值，在免疫调节[3-5]、抗肿瘤[6-8]、抗氧化[9-10]、降血糖[11-12]以及解酒护肝[13-14]等方面具有极高功效，在食品、药品和化妆品等行业有着广阔的应用前景[15-16]。

近年来灵芝消费市场不断扩大，然而主要多为灵芝孢子粉等初加工产品，深加工产品较少，现有片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等，由于其口感不佳或具有不良气味等原因都存在各自的缺陷[17]。功能性饮料作为新兴食品，不仅能够及时补充人体所需的营养元素，还具备口感风味好，易服用等特点，逐渐成为灵芝深加工的研究热点[18]。本文以灵芝多糖为主要原料，以具有一定解酒护肝功效的葛根提取物、谷胱甘肽、VC、姜黄素为辅助原料[19-22]，添加白砂糖、柠檬酸、芒果浓缩汁提升产品风味，研发得到灵芝多糖功能性饮料，并分析其体外抗氧化活性，有效提高灵芝多糖的经济及利用价值，为灵芝多糖的深加工提供一定的科学参考和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

灵芝孢子粉，广东元德中药饮片有限公司；葛根提取物，陕西艾特生物科技有限公司；水溶粉状姜黄，河南中大恒源生物科技股份有限公司；还原型谷胱甘肽、VC，广州客源食品配料有限公司；白砂糖、柠檬酸，潍坊英轩实业有限公司；浓缩芒果汁，漳浦县达川食品工业有限公司；芒果香精，深圳市振芯嘉贸易有限公司；无水乙醇、冰醋酸、硫酸、三氯乙酸、水杨酸，广州化学试剂厂；纤维素酶，山东隆科特酶制剂有限公司；硫酸亚铁、过氧化氢、磷酸缓冲液、氯化铁，天津福晨化学试剂有限公司；铁氰化钾，苏州信清科技有限公司。

1.1.2 设备与设备

101-3AB 型电热鼓风干燥箱、FW177 中药材粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；SC-3614 高容量低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅，上海江星仪器有限公司；T6 紫外可见分光光度计，济南来宝医疗器械有限公司；pH-100 笔式酸度计，上海力辰邦西仪器科技有限公司；LH-Q90 型折光仪，杭州陆恒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 灵芝多糖的提取

参考丁霄霄等[23]的方法并略作修改。精密称取5 g 灵芝破壁孢子粉残渣，按照一定料液比溶解于蒸馏水中后添加纤维素酶，混匀，在50 ℃恒温水浴锅中酶解90 min，90 ℃下灭酶活并浸提1 h。将粗提液冷却至室温后在4 000 r/min 条件下离心10 min，添加无水乙醇醇沉过夜，离心后取沉淀，收集沉淀在60 ℃烘箱中干燥至恒重，得到灵芝多糖。

1.2.2 灵芝多糖功能饮料制备工艺

灵芝多糖功能饮料的制备工艺流程参见图1。

图1 灵芝多糖功能饮料制备工艺流程图Fig.1 Preparation process flow chart of G. lucidum polysaccharide functional beverage

1.2.3 灵芝多糖提取单因素试验及正交试验设计

1.2.3.1 料液比的确定

在酶解温度50 ℃，酶解时间60 min，酶用量3%的条件下，考察不同料液比（1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65（g/mL））对灵芝多糖得率的影响。

1.2.3.2 酶解温度的确定

在料液比1∶35（g/mL），酶解时间60 min，酶用量3%的条件下，考察不同酶解温度（25、40、55、70、85 ℃）对灵芝多糖得率的影响。

1.2.3.3 酶解时间的确定

在料液比1∶35（g/mL），酶解温度50 ℃，酶用量3%的条件下，考察不同酶解时间（25、50、75、100、125 min）对灵芝多糖得率的影响。

1.2.3.4 纤维素酶用量的确定

在料液比1∶35（g/mL），酶解温度50 ℃，酶解时间60 min 的条件下，考察不同纤维素酶用量（1%、3%、4%、5%）对灵芝多糖得率的影响。

1.2.3.5 正交试验设计

为获得灵芝多糖提取的最佳工艺条件，在上述单因素试验的基础上，同时考虑降低提取过程中的能耗，以灵芝多糖得率为指标，进行L9(34)正交试验，试验因素水平设计如表1 所示。

表1 灵芝多糖提取工艺的正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test for G. lucidum polysaccharide extraction

1.2.4 灵芝多糖功能饮料感官评价方法

取一定量混合均匀的被测样品置于50 mL 无色透明烧杯中，在自然光下观察色泽，鉴别气味，用温开水漱口，品尝滋味，检测其有无异味及异物。以色泽、气味、口感、液体状态等感官指标作为考察标准，根据表2 进行多指标综合评分。

表2 感官品质评分标准Table 2 Sensory qualities scoring standards

1.2.5 灵芝多糖饮料配方的单因素试验及正交试验设计

1.2.5.1 白砂糖添加量的确定

固定灵芝多糖2.5 mg/mL，葛根提取物1%，谷胱甘肽0.1%，VC 0.1%，姜黄素0.03%，芒果浓缩汁5%，柠檬酸0.3%，芒果香精0.02%，考察不同白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%）对灵芝多糖功能饮料感官品质的影响。

1.2.5.2 柠檬酸添加量的确定

在“1.2.5.1”配方的基础上，设置白砂糖添加量为10%，芒果浓缩汁添加量为5%，考察不同柠檬酸添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）对灵芝多糖功能饮料感官品质的影响。

1.2.5.3 芒果浓缩汁添加量的确定

在“1.2.5.1”配方的基础上，设置白砂糖添加量为10%，柠檬酸添加量为0.3%，考察不同芒果浓缩汁添加量（1%、3%、5%、7%、9%）对灵芝多糖功能饮料感官品质的影响。

1.2.5.4 正交试验设计

为获得灵芝多糖功能饮料的最佳感官品质，在上述单因素试验的基础上，以感官评分为考察指标，进行L9(34)正交试验，试验因素与水平如表3 所示。

表3 灵芝多糖功能饮料配方的正交试验因素与水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal test for G. lucidum polysaccharide functional drink formula 单位：%

1.2.6 灵芝多糖得率的测定

标准曲线绘制：取无水葡萄糖标准品适量，精密称定，加水制成0.12 mg/mL 的溶液。精密量取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于10 mL 试管中，各加水至2.0 mL，加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL 使溶解，摇匀）6 mL，摇匀，放置15 min 后，置冰浴中冷却15 min，取出，每组试验设置3 个平行，以空白组为参比溶液，采用紫外-可见分光光度法于625 nm 处测吸光度，绘制标准曲线。

精密量取供试品溶液2.0 mL，照标准曲线绘制项下的方法，自“加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，根据标准曲线读出灵芝多糖浓度，后计算灵芝多糖提取得率。灵芝多糖得率计算公式如下：

式中：W 表示灵芝多糖得率，%；C 表示灵芝多糖浓度，mg/mL；V 表示定容体积，mL；N 表示稀释倍数；m表示样品质量，g。

1.2.7 灵芝多糖功能饮料抗氧化活性研究

1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力测定

参照Mccue 等[24]的方法并略作修改。将样品配制成不同浓度梯度，分别加入1.0 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 自由基乙醇溶液和1.0 mL 灵芝提取液，再用95%乙醇定容至100 mL。将制备好的溶液在阴暗处常温放置30 min。以蒸馏水为空白对照，用可见分光光度计于517 nm 波长处检测吸光值，计算DPPH 自由基清除率。计算公式如下：

式中：X1表示DPPH 自由基清除率，%；A0表示空白对照的吸光度值；Ai表示加入样品的吸光度值；Aj表示样品本身的吸光度值。

1.2.7.2 羟基自由基清除能力测定

参考乔冬等[25]的测定方法，将样品配制成不同浓度梯度，准确吸取1 mL 样品溶液，分别加入1 mL FeSO4（6 mmol/L）溶液和H2O2（6 mmol/L）溶液摇匀，静置10 min，再加入1 mL 水杨酸（6 mmol/L），摇匀后静置30 min。以蒸馏水为参比，用紫外分光光度计于510 nm 处测吸光度，计算羟基自由基清除率。

式中：X2表示羟基自由基清除率，%；A0表示空白对照吸光度；Ai表示加入样品液的吸光度值。

1.2.7.3 总还原力测定

参照林捷等[26]的测定方法，采用铁氰化钾比色法，在不同浓度样品溶液中分别加入铁氰化钾溶液2.5 mL、0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液2.5 mL，将混合液置于50 ℃水浴中反应30 min，快速冷却后先后加入2.5 mL 三氯乙酸溶液和0.5 mL 三氯化铁溶液，用紫外可见分光光度计于700 nm 波长处检测吸光值。

1.2.8 数据处理

试验中的定量分析进行3 次重复，结果取平均值并计算标准差，采用Origin 9.0 作图分析，SPSS 25.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 灵芝多糖最佳提取条件分析及确定

如图2 所示，灵芝多糖得率随提取剂添加量的增大不断升高，料液比为1∶65（g/mL）时得率达到最大，为2.39%。而在料液比1∶55（g/mL）后灵芝多糖得率上升趋势变缓，无显著性差异；缩小料液比不利于提取能耗的控制，故1∶55（g/mL）可视为最小料液比取值。在酶解温度55 ℃时，灵芝多糖得率达到最高，而后开始缓慢降低。这可能是由于温度的升高影响了酶的活性，从而减弱了酶解速率，使多糖得率也逐渐降低。灵芝多糖得率随酶解时间的延长呈现先升后降的趋势，在酶解时间为100 min 时得率最高，为1.89%。随着酶解时间的不断升高，原料和纤维素酶也在不断消耗，在100 min 后酶活性可能开始降低，影响多糖的进一步提取[27]。灵芝多糖得率随纤维素酶用量的增加呈现先上升后下降再上升的趋势，这可能是由于随着酶用量的增多，使酶能够与底物充分结合，酶解速率升高，灵芝多糖得率提高。继续增大酶用量，相对液体量较少，使酶解过程中酶的转移受到限制，酶解速率降低，多糖含量减少[28]。

图2 不同酶解条件对灵芝多糖提取得率的影响Fig.2 Effects of different enzymolysis conditions on extraction yields of G. lucidum polysaccharide

在单因素试验的基础上进行正交试验，优化工艺参数，结果如表4 所示。由数据分析可知，酶浸提法提取灵芝多糖中各影响因素大小排序为：A＞D＞C＞B，且最佳理论提取组合为A3B2C1D2，即料液比1∶55（g/mL），酶解温度50 ℃，酶解时间60 min，纤维素酶用量3%，此时灵芝多糖得率为2.89%。

表4 灵芝多糖提取工艺的L9(34)正交试验设计及结果Table 4 L9(34) Orthogonal test design and results for extractiontechnology of G. lucidum polysaccharide

2.2 灵芝多糖功能饮料配方的优化

由图3 可以看出，随着白砂糖添加量的增加，灵芝多糖功能饮料的口感和甜度更符合人们的口味，因而感官评分也随之增加。当白砂糖添加量超过10%时，口感变为较甜腻，感官评分降低，故白砂糖添加量为10%时最佳。

图3 白砂糖添加量对灵芝多糖功能饮料感官评分的影响Fig.3 Effects of white sugar additions on sensory scores of G. lucidum polysaccharide functional beverage

柠檬酸作为食品工业中常用的食品添加剂，可以为饮品带来独特的酸性风味并有效保持食品品质[29]。由图4 可见，灵芝多糖功能饮料的感官评分随柠檬酸添加量的增加呈现先升高后下降的趋势。柠檬酸添加量较小时，感官评分较低，这是因为柠檬酸浓度较低时无法中和饮料中的涩味，影响口感和风味；而柠檬酸添加量较大时，则饮料过酸。当柠檬酸添加量为0.3%时，灵芝多糖功能饮料的感官评分最高。

图4 柠檬酸添加量对灵芝多糖功能饮料感官评分的影响Fig.4 Effects of citric acid additions on sensory scores of G. lucidum polysaccharide functional beverage

由图5 可见，随着芒果浓缩汁添加量的增加，感官评分呈现先升后降的趋势。这可能是因为添加量较小时无法掩盖饮料中药材的味道，添加量较大又会出现过于浓郁的果汁风味，在芒果浓缩汁添加量为5%时灵芝多糖功能饮料的口感及风味最为合适。

图5 芒果浓缩汁添加量对灵芝多糖功能饮料感官评分的影响Fig.5 Effects of mango juice concentrate additions on sensory scores of G. lucidum polysaccharide functional beverage

根据表5 正交试验分析结果可知，各因素对饮料品质和风味的影响主次顺序为B＞A＞C，通过正交试验结果分析可知，灵芝多糖功能饮料最优配方组合为A1B2C1，此时饮料的感官评分为86.5 分。

表5 灵芝多糖功能饮料配方的L9(34)正交试验设计和结果Table 5 L9(34) orthogonal test design and results for G. lucidumpolysaccharide functional beverage formula

2.3 抗氧化活性测定结果

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

DPPH·清除率曲线如图6 所示，对DPPH·的清除能力可以作为灵芝多糖功能饮料抗氧化活性的衡量指标。在本试验浓度范围内，灵芝多糖功能饮料DPPH·清除率随样品浓度的增加而升高，样品浓度为2.5mg/mL 时，DPPH·清除率达到91.2%，采用SPSS 25.0计算后可得半清除率（IC50）为0.537 mg/mL，说明灵芝多糖功能饮料对DPPH·具有一定清除能力，存在良好的抗氧化活性。

图6 DPPH·清除率曲线图Fig.6 Scavenging rates curve on DPPH·

2.3.2 羟基自由基清除能力

人体的免疫反应常常伴随着羟基自由基的产生，清除体内多余的羟基自由基对人体内稳态的维持非常重要[10]。羟基自由基清除率曲线如图5 所示，灵芝多糖功能饮料的羟基自由基清除率随样品浓度的增加呈持续上升趋势，在样品浓度为0.8 mg/mL 后趋于平缓，IC50为0.65 mg/mL。试验证明灵芝多糖功能饮料能够有效清除羟基自由基，但清除能力不呈现线性关系。

图7 羟基自由基清除率曲线图Fig.7 Scavenging rates curve of hydroxyl radicals

2.3.3 总还原力测定

还原力越强，抗氧化性越强。通过图8 可以看出，灵芝多糖功能饮料的还原能力随样品浓度的增加而增强，还原能力随着浓度的变化从0.31%增加到1.15%。通过总还原力的测定，可以发现灵芝多糖功能饮料具有较好的还原能力，结合DPPH·清除力和羟基自由基清除力，进一步说明灵芝多糖功能饮料具有较强的抗氧化作用。

图8 总还原力曲线图Fig.8 Curve of total reducing power

3 结论

采用酶浸提法提取灵芝多糖，通过单因素试验与正交分析，对灵芝多糖提取工艺进行优化，当料液比为1∶55（g/mL），酶解温度为50 ℃，酶解时间为60 min，纤维素酶用量为3%时，灵芝多糖提取得率达最高值2.89%。以灵芝多糖为主要原料，结合单因素试验和正交试验，确定灵芝多糖功能饮料的最佳工艺配方为：灵芝多糖含量2.5 mg/mL，葛根提取物1%，白砂糖10%，芒果浓缩汁4%，柠檬酸0.2%，谷胱甘肽0.1%，VC 0.1%，姜黄素0.03%，芒果香精0.02%，该产品颜色呈纯正的浅褐色，口感酸甜，爽口清新，具有良好的风味。

通过研究灵芝多糖功能饮料的DPPH·清除率、羟基自由基清除率和总还原力，试验结果表明，DPPH·清除能力和羟基自由基清除能力的IC50分别为0.537 mg/mL 和0.650 mg/mL，还原能力在浓度为2.5 mg/mL 时达到1.15%，说明灵芝多糖功能饮料具有良好的抗氧化能力。本研究对高效提取灵芝多糖并加工成口感优良、服用方便的灵芝多糖功能食品具有一定的参考价值。解酒护肝产品的主要原理在于可以促进乙醇分解，消除肝组织和血浆中的自由基，增强抗氧化能力[30]，后续可以就该功能饮料在解酒护肝功能及其作用机理方面进行更深入的研究；同时也可以将灵芝多糖在其他保健功能如抗辐射、预防肿瘤等功能食品的开发与应用上做更广泛的研究与探讨。