果实采后响应病原菌侵染的生理生化及分子机制研究进展

程 辰，纪艳青，冷 鹏，艾合买提江，刘 军，刘云国,*

（1. 新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830002；2. 临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000；3. 临沂市农业科学院，山东 临沂 276000）

水果为人类饮食中不可缺少的一部分，其营养丰富，但在贮藏过程中极易腐败而造成严重损失。大多数情况下，水果采摘后仅简陋包装，甚至没有包装；贮藏和运输过程中会因为挤压、摩擦而出现机械损伤，损伤处极易受病原菌侵染而腐烂变质。果实因腐败而造成的损失主要发生在采摘后，据测算，果蔬流通腐损率高达20%～30%，每年损失1 000 多亿元[1]。因此研究果实采后对病原菌侵染发生的应答反应机制，对于减少采摘后果实的损失具有十分重要的意义。

真菌侵染是引起果实腐败的一个主要因素（见表1），由于腐败微生物可以寄生或腐生在种子、土壤、灌溉水、肥料中。采摘后的果实因保存不当等因素很容易受到微生物的侵染而腐烂。果实富含多种矿物质、维生素以及糖分，水分活度高，这为细菌、霉菌、酵母菌的生长提供了有利条件，但由于大多数水果的pH小于4.5，比细菌最适生长pH 值低，但适合酵母菌与霉菌生长的pH 值较广[2-3]，因此，一些酵母菌、霉菌会在果皮表面繁殖并深入果内，使果肉变酸腐烂。若采后贮藏不当，果实非常容易被腐败霉菌侵染（尤其是青霉属、曲霉属、葡萄孢属和链格孢属[4]的霉菌），从而引起果实的迅速腐烂。本文综述了果实在生理生化和分子机制方面抗病性的途径，以期增进人们对果实抗病性的认识和利用。

表1 几种常见果实采后病害Table 1 Several common postharvest diseases of fruits

1 果实细胞结构表现的抗性

果实细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶多糖和蛋白质组成，其对大多数病原菌具有防御作用[16]，病原菌通常通过释放细胞壁降解酶来打破这一屏障，然后侵入果实内。果实细胞壁由薄壁细胞构成，比较薄，而且胞间层不发达，病原菌很易侵入[17]。但在受到病原菌的侵染后，果实细胞壁也会做出相应的抗性反应。

细胞壁作为一个被动的屏障可以抵御病原菌的侵染。例如，病原菌侵染过的果实部位，会沉积胼胝质、木质素和酚类化合物等与果实抗病性密切相关的物质。在病害发生的初期，利用扫描电镜可以明显观察到果实的细胞壁会变厚，这是宿主对入侵者表现出的抗性反应。具体表现为致密性物质沉淀增多，沉淀物的主要成分为纤维素、半纤维素、β-1,3-葡聚糖等，这些物质是抵御病原菌侵染的防御系统主要成分[18-19]。近年来，越来越多的学者开始报道采后外源处理对果实细胞壁结构抗病性的影响。孙翠[20]使用扫描电镜观察青霉侵染后的梨果实伤口组织的超微结构，发现β-1,3-葡聚糖处理会诱导梨果实细胞壁加厚，增强其抗病性。Han 等[21]利用光学显微技术和透射显微技术研究了轮纹病菌在侵染果实的互作过程。在苹果上接种病原菌后，菌丝侵入皮层厚角组织，最后发育成分生孢子器，与此同时寄主细胞壁膨胀变形，苹果病伤组织附近形成周皮从而阻止了病原菌扩散。

在防御病原菌侵染时，由于果实品种和个体之间都存在差异，细胞壁发生的抗性反应也不同。Luo 等[22]用青霉侵染红阳和祁阳两个品种的猕猴桃，红阳猕猴桃接种青霉后的发病率更低，病斑直径较小，表现出较强的组织结构抗性。通过扫描电镜观察果皮结构，红阳猕猴桃的果皮结构具有典型的抗病特征，即表皮结构致密，细胞排列整齐，微裂缝不明显。通过对比研究抗性品种和易感品种，对揭示果实细胞壁的抗病机制有重要意义。

当病原菌突破细胞壁的防御时，还会引起细胞内部结构的变化。赵娟[23]对接菌后不同侵染时间的梨愈伤组织进行普通细胞学观察，发现组织内部侵染进程与表观变化一致。进行DAPI 染色后观察发现，轮纹病菌侵染初期梨组织细胞核出现染色质的不均一，核质浓缩并有部分细胞核DNA 发生断裂的现象。提取愈伤组织的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳后发现：轮纹病菌侵染的24～48 h 时出现了较为明显的DNA Ladder现象，但是褐腐病菌侵染的组织未发现上述现象。这可能是梨组织在防制轮纹病菌侵染的过程中发生了细胞过敏性反应，这对研究果实细胞核抗性变化具有重要意义。目前，有关果实细胞核在病原菌侵染过程中形态结构变化的研究较少，尚不能确定果实细胞核如何表现抗性。

2 果实防御酶系统表现的抗性

果实被病原菌侵染后发生的保护反应是复杂的新陈代谢过程，其对病原菌侵入及扩展的生理反应是以酶的活动而实现的。健康状态下，果实体内防御酶系统处于平衡状态，而被病原菌侵染后，果实体内的防御酶如过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、脂氧合酶（LOX）等的活性会发生变化。当水果被轮纹病菌和褐腐病菌侵染后，以梨为例，其愈伤组织防御酶PPO、PAL 等的活性均呈先升高后降低的趋势，但不同酶的酶活性高峰峰值和出现的时间不同[24]，被轮纹病菌侵染的果实愈伤组织内酶活性升高速度快、上升幅度大，酶的高活性维持时间长，说明防御酶系酶活性被诱导和加强应该是梨愈伤组织抗轮纹病的表现之一。

研究防御酶活性的变化规律可以为鉴定果实染病后的早期抗性提供参考。张宁[25]研究发现，甜瓜接种蔓枯病菌后不同时间3 种防御酶PAL、PPO 及POD 活性与甜瓜对蔓枯病的抗性关系非常密切。甜瓜受蔓枯病菌侵染后，防御酶活性比对照明显增高，其中PAL 和PPO 活性整体呈先缓慢上升再快速上升最后缓慢回落的趋势，在接种病菌4 d 时达到峰值；而POD 活性在接种3～5 d 时迅速上升，并且后期仍然保持活性上升的状态。还有研究者发现[26]，果实防御系统酶在果实被侵染的各个时期都起作用，如哈密瓜中相关抗性酶：POD 等参与了抵御青霉菌侵染的反应；贮藏前期，低温和保鲜剂处理可以诱发抗性酶活性升高；贮藏后期，霉菌侵染再次诱导防御酶活性升高，提高哈密瓜的抗病性。对采后果实中抗病性相关酶活性进行分析测定，可了解相关防御酶在控制病害中的作用，为采后果实的保鲜提供理论依据。

3 果实代谢产物表现的抗性

果实与病原菌相互作用的过程中，体内会发生一系列的信号传递，这会激发植物的防御体系，使植物产生抗病性反应，如超敏反应（HR）、系统获得性抗性（SAR）和诱导的系统抗性（ISR）[27]。这样的防御系统由几种植物激素协作完成，如水杨酸、茉莉酸、乙烯等。

水杨酸（Salicylic acid, SA）作为植物内生激素，不仅在植物生长中扮演着重要角色，还可以激活防御信号来诱导植物合成防御化合物。Wang 等[28]在白僵菌（Botryosphaeria dothide）侵染的苹果愈伤组织中检测到内源水杨酸水平升高，发现苹果组织存在通过调节SA 合成途径来提高对白僵菌的抵抗力，说明SA 能够诱导果实产生获得抗菌性，从而有效抑制病程发展。

茉莉酸（Jasmonic acid, JA）也是一种植物内生调节物质，作为信号物质在植物生长发育，尤其是抵御生物和非生物胁迫等生物学进程中起着非常重要的作用[29]。JA 信号通路包含了两条支路：一条是能对机械损伤和害虫侵蚀做出应答的MYC 支路；另一条是能增强死体营养型病原体抗性的ERF 支路[30]。在Yao等[31]的研究中发现，接触过砧木的柑橘被假丝酵母（Candidatus Liberibacter asiaticus，CaLAS）侵染而获得柑橘黄龙病的几率大大下降，iTRAQ 蛋白质组图谱分析验证表明：健康果实上的差异表达蛋白远远多于染病果实的差异表达蛋白，染病果实的许多防御相关蛋白表达下调，导致茉莉酸合成途径、茉莉酸信号转导途径、小泡运输途径等受阻。因此，可以推测茉莉酸信号通路相关蛋白的变化与柑橘对CaLAS 病原菌的敏感性有关，还可推测果实调动次生代谢物抑制病原菌效应表达的同时，也利用其胞内免疫受体（主要是NLR 蛋白）识别进入到其细胞内部的效应蛋白，激活免疫反应，保护自身免受侵害。

乙烯作为一种常见的果实类代谢产物，作用机制为激活防御酶系统以增强果实的抗氧化性能。Dong等[32]研究发现乙烯可以诱导成熟果实在感染后产生抗性。其机理为：乙烯通过激活抗氧化系统，诱导自由基清除系统工具酶的活性，导致防御反应的发生，从而增强组织的抗性及对伤害胁迫的适应性。

研究表明，无论是抗病植物还是感病植物，都具有潜在的抗病能力，这一潜在的抗病能力可经诱导表达出来。水杨酸、茉莉酸和乙烯作为外源调控物质处理果实，可诱导果实获得对病原菌进一步侵害的抵抗反应。

4 基因介导的果实抗病反应

4.1 果实防卫基因

防卫基因是一类在抗病机制中最终起作用的基因，受病原体等分子的诱导，它们的编码产物直接或间接地作用于病原体[33]。它们与植物抗病基因的区别在于防卫基因及其表达产物并不像抗病基因那样仅抗病植株所特有，而是在感病植株中也存在，只是感病植株中的防卫基因相对抗病植株被激活得慢且表达微弱而已，抗病基因编码产物具有特异性，而防卫反应基因编码产物具有普遍性[34]。即不同的寄主植物中有一套类似的防卫反应基因，抗病基因产物是果实防卫反应基因表达的直接或间接调节因子，防卫反应基因一般受病原体诱导表达，编码产物比较容易分离。

4.1.1 次生物质合成基因

次生物质合成基因在果实抗病中具有重要的作用，其表达产物包括富含轻脯氨酸的糖蛋白、植保素、木质素合成关键酶、乙烯和酚类化合物合成酶等[35]。Liu 等[36]发现SLMYB75 基因的过度表达促进了茉莉酸的积累，并促进了JA 介导的信号通路抵抗灰霉病菌的侵染。在转基因番茄植株中，过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性被激活，以清除由灰霉病菌侵染产生的过氧化氢。用扫描电镜观察到转基因番茄果皮表面的蜡质虽然有所减少，但SLMYB75 通过提高果实对灰霉病的抗性，延长了果实的贮藏期。Sun 等[37]利用PCR 和cDNA 末端快速扩增技术分离到一个新的猕猴桃类NPR1 基因，命名为AeNPR1a。同源性分析表明，猕猴桃AeNPR1a 表达蛋白与葡萄的VvNPR1 表达蛋白有明显的相似性。从猕猴桃中克隆的AeNPR1a基因在转基因烟草中表达，提高了烟草对病原菌的耐受性。

4.1.2 细胞壁修饰相关基因

纤维素、半纤维素、β-1,3-葡聚糖等的积累是果实防卫反应中细胞壁成分变化的主要表现。研究表明，这些物质既是细胞壁的固有组成成分，也可以在病原菌侵染时通过诱导而产生，而这些物质的产生受到基因的调控。Shan 等[38]研究表明，香蕉的转录因子MaBZR1/2 与MaMPK14 相互作用，增强细胞壁修饰基因MaEXP2、MaPL2 和MaXET5 的转录抑制作用。Jaiswal 等[39]研究生物炭诱导番茄植株对土传尖孢镰刀菌（Fusarium oxyporum f.sp.）冠腐病的系统抗性的能力时，在番茄的转录分析（RNA-seq）中发现生物炭对基因表达具有启动作用，上调了茉莉酸、油菜素甾体、细胞分裂素、生长素等与植物防御和生长相关的途径和基因，增加了类黄酮和苯丙烷的合成。细胞壁合成的关键基因，如纤维素合成酶（CS）、1，4-β-D-木聚糖合成酶（XS）和糖基转移酶（GT）合成基因的表达上调。

4.1.3 病程相关蛋白基因

病程相关蛋白是指只有在病理或病理相关的环境下才被诱导产生的蛋白[40]。Shan 等[41]研究发现香蕉果实转录因子WRKY、MaWRKY1 和MaWRKY2 通过与病程相关基因（PR）启动子结合，参与了水杨酸和茉莉酸甲酯诱导的对炭疽病菌的抗性。香蕉在感染炭疽病菌（Colletotrichum musae）后，3 种转录因子MaNAC1、MaNAC2 和MaNAC5 的表达上调，SA 和茉莉酸甲酯（MeJA）处理也显著增强了MaWRKY1 和MaWRKY2 的表达。病程相关蛋白可被多种因子所诱导表达，并在植物抗病以及适应其它环境胁迫中起到重要作用[42]。Li 等[43]将番茄接种灰霉后，病程蛋白相关基因表达显著增加。过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶活性的升高和过氧化氢酶活性的降低共同调节了番茄的活性氧动态平衡。此外，茉莉酸和乙烯信号通路中涉及的防御基因的诱导进一步增强了番茄的抗病性。

4.2 果实抗病基因

研究果实抗病基因是进一步研究果实抗病机制的关键。抗病基因介导的抗性反应主要存在以下机制：抗病基因编码产物能钝化病原菌侵染时产生的毒素，进而抑制病原菌的繁殖，显性基因能编码病原菌致病性的靶标物，若果实缺乏该靶标物就会产生抗性抗病基因表达产物，引发抗病反应[44]。张政等[45]利用农杆菌介导进行Pti6 基因遗传转化，获得Pti6 基因过表达番茄植株，对其表型进行初步分析，发现在Pti6 过表达番茄果实中，CAT 和POD 活性显著提高，CAT 和POD 的活性高低直接影响了酚类物质的代谢，有效抵御丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的侵染，表明番茄Pti6 基因在番茄抗病中发挥了作用。

果实抗病基因表达产物能特异性识别病原菌中相应无毒基因编码的产物，并产生信号分子，这些信号分子经信号传递因子传递后，启动植物防卫基因的表达，最终对病原菌产生抗性，编码植物新陈代谢相关酶的基因在植物病害防治中起到关键性作用。王秋颖[46]研究发现粉红粘帚霉菌（Clonostachys rosea）或其代谢产物或与灰霉（Botrytis cinerea）的互作产物为诱导物激发子，引发番茄对抗灰霉病的非寄主抗性；启动超敏反应和系统获得性抗性，诱导潜在防御基因atpA 和Lexyl2 的活化，增强已活化基因WRKY 和MAPK 的表达；有效减轻了B.cinerea 侵染导致的细胞和叶绿体超微结构损伤；促进了PAL、PPO、H2O2和NO 升高，降低了CAT 活性，从而使番茄更加有效地抵抗灰霉的侵染。目前，有关果实抗病基因表达调控分子机制的有关资料还较为零碎，尚难形成整体认识，这将是今后研究的主题。

5 小结与展望

果实防卫反应的相关研究现已取得显著进展，果实细胞壁是通过沉积胼胝质、木质素的方式增加厚度，抵御病原菌的侵染；受到侵染后的果实体内的防御酶，如过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活性升高，从而提高了果实的抗病性；代谢产物水杨酸和乙烯激活相关信号通路来诱导果实合成防御化合物，但仍有许多尚未解答的问题，如调控细胞壁增厚的准确机制，相关防御酶和代谢产物参与果实防卫反应的调控机制等。果实在受到病原菌侵染后，果实细胞的各种生理生化机制都在不断地发生变化，果实靠这种动态平衡来维持自身的各种新陈代谢。但是不同类型的果实对不同病原菌的感抗性表现不同，其生理的变化也各不相同，这些变化反应了果实细胞与病原菌之间长期相互作用的复杂性，甚至同一类型果实不同个体之间也存在着较大的差异，这为研究果实采后的统一机制增加了难度。因此，需要更深层次地研究果实抗病的相关机理，为研究果实抗病机制提供更多新的思路。

随着现代生物信息学和高通量测序方法的普及和应用，可以将果实的生理生化抗性与果实抗病基因相结合，探讨果实响应病原菌侵染后的抗性反应。今后还可通过代谢工程操纵生化途径，大规模生产果实抗病相关产物及其在田间种植上的应用，绿色高效地解决采后果实易被病原菌侵染的问题。由于果实抗病不仅受某个基因的调控，还可能与功能蛋白或基因相互作用或有关，这可以作为将来的研究方向之一。