小型猪在人类疾病模型方面的研究进展

吴华莉，涂尾龙，曹建国，王洪洋，范 春，王胜昌，赵 莹，谈永松

（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 闵行 201106；2.上海市种猪工程技术研究中心，上海 浦东 201302；3.上海实验动物研究中心，上海 浦东 201302）

随着人类疾病研究的不断发展，对实验动物的需求越来越大，不仅对常用的小鼠和大鼠的数量增加，对其他动物如兔、犬等实验动物的数量也在增加。然而这些实验动物和人在生理特征和基因表达等方面有所不同，不能充分模拟人类疾病，而猪由于在解剖学、神经生物学、心脏血管系统、胃肠道和基因组等方面更接近人类，是理想的人类疾病模型[1-3]。猪作为一种动物模型能够为分子生物化学研究提供足够的组织和血液，而且猪的寿命长可以详细跟踪疾病的进展。例如Baxa等对小型猪的亨廷顿氏病模型进行系列研究时间长度达到8年，这在其他实验动物身上是不可能的[4]。科研工作者以小型猪为医学实验动物模型进行大量研究，尤其作为人类疾病研究的动物模型近年来得到很大发展。

1 用于人类疾病模型的小型猪品种

国内用于人类疾病模型的小型猪品种有广西巴马小型猪、贵州小型猪、五指山小型猪近交系和西藏小型猪等[5-6]。国外用于人类疾病模型的小型猪品种有哥廷根系（Goottingen）、尤卡坦系（Yucatan）、明尼苏达-荷曼小型猪（Minnesota-Hormel）、皮特曼-摩尔小型猪（Pitman-Moore）、科西嘉小型猪（Corsica）和汉佛特小型猪（Hanford）等[7-9]。

2 小型猪在人类疾病模型研究的进展情况

2.1 在心血管疾病模型方面

猪被认为是人类心血管系统的理想实验动物模型，因为猪的心脏形态、功能、血流动力学和代谢方面与人类相似[10-11]。研究者采用基因修饰技术构建人心血管疾病转基因猪模型，包括内皮一氧化氮合酶（eNOS）转基因猪、过氧化氢酶（hCat）转基因猪、载脂蛋白CIII（ApoCIII）转基因猪和过氧化物酶体复合物-γ（PPAR-γ）基因敲除猪。Hao等采用尤卡坦小型猪生产eNOS转基因猪。血管功能、血管结构和稳态部分受内皮细胞eNOS释放的一氧化氮（NO）调控，在机体健康和疾病中，eNOS释放的NO在调节骨骼和心肌代谢中发挥重要作用。转基因猪的eNOS基因由一个Tie-2启动子驱动，并标记V5 His标签，目的在于了解eNOS对心血管的调节作用[12]。Whyte等以内皮特异性方式过表达hCat，培育转基因尤卡坦小型猪，目的在于研究过氧化氢（H2O2）在血管健康和疾病机制中发挥的作用。hCat代谢H2O2，H2O2是血管紧张度的重要调节因子，可导致动脉粥样硬化和子痫前期等疾病[13]。Wei等报道ApoCIII转基因小型猪模型的产生，以研究高脂血症与动脉粥样硬化疾病的关系。高甘油三酯血症被认为是冠心病的独立危险因素，心血管疾病与脂蛋白代谢密切相关，ApoCIII与血浆甘油三酯水平密切相关。在转基因猪中，发现血浆甘油三酯水平升高，血浆甘油三酯清除延迟，脂蛋白脂肪酶活性降低[14]。Yang等报道，生产PPAR-γ基因敲除猪，PPAR-γ在心血管疾病中起重要作用。PPAR-γ激动剂噻唑烷二酮类（TZDs）是临床应用于治疗2型糖尿病的胰岛素增感剂。生产小型猪模型目的在于研究PPAR-γ和TZDs在糖尿病和心血管并发症中的功能[15]。陈民利等建立了小型猪慢性心肌缺血模型，对五指山猪、巴马小型猪和西藏小型猪的运输应激和高脂诱导发生动脉粥样硬化（AS）的危险因素进行评估[16]。小型猪慢性心肌缺血模型，对于心脏疾病的研究与治疗方面具有重要意义[17-18]。五指山小型猪被用于构建急慢性心肌缺血模型、致急性心肌梗死模型、心力衰竭模型和心肺复苏后心肌代谢评估等疾病模型[19]。

2.2 亨廷顿氏病模型

亨廷顿氏病（Huntington's disease, HD）是一种遗传性毁灭性的神经退行性疾病[20]。目前尚无治愈方法，治疗HD的方法在临床应用之前需要对其安全性、耐受性和有效性进行测试。由于编码亨廷顿（Huntingtin, Htt）蛋白的基因突变引起胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤序列重复扩增，导致Htt蛋白氨基端的多聚谷氨酰胺膨胀和突变蛋白积累。具有致病性鸟嘌呤序列重复次数与疾病的严重程度和发病年龄密切相关。这种疾病具备单遗传性质，从而使生产携带突变亨廷顿蛋白（the mutated huntingtin, mHTT）的转基因动物模型成为可能[21]。Baxa等生产表达人亨廷顿蛋白的N端区域的转基因亨廷顿病小型猪（transgenic HD minipig boars, TgHD）[22]。突变亨廷顿蛋白（mtHtt）不仅导致大脑神经元变性，也会影响生殖系统。Macakova等对F1代（24～48月龄）和F2代（12～36月龄）转基因小型猪（TgHD）和野生型（WT）的小型猪精子和睾丸的生殖细胞学参数和电镜图像进行比较，结果发现24月龄和36月龄TgHD公猪的精子尾部和睾丸上皮细胞中有许多病理特征，睾丸中精原细胞的增殖活性显著降低。mtHtt在TgHD公猪精子和睾丸中高表达，并定位于所有输精管细胞中，研究结果证实TgHD公猪的精子和睾丸变性是由高表达的mtHtt功能获得引起的[23]。Askeland等检测48月龄TgHD猪线粒体DNA损伤和代谢改变的标记物[21]。Ardan等在TgHD猪5～5.8岁时，检测HD 的病理特征，在新纹状体和大脑皮质以及一些神经元轴突中检测到基因型特异性的显著细胞丢失[24]。Baxa等检测8岁前TgHD猪的运动、认知和行为表型，建立新的测试方法调查TgHD猪的身体活动，并探索其在压力诱导下的行为和认知变化。结果显示了6～8岁的TgHD猪和野生型猪之间的显著差异，与野生型野猪相比，4.6～6.5岁的TgHD公猪在午餐期间和下午的体力活动都有所增加[4]。基于小型猪建立亨廷顿氏病模型研究的结果，美国食品和药物管理局和欧洲药品评估机构批准其用于第一期和第二期临床试验。研究者生产TgHD的意义在于通过大型动物模型反映人类疾病进展情况，从而有助于测试潜在治疗HD的方法和缩短患者治疗的时间。

2.3 侏儒病模型

骨的生长主要受生长激素（GH）和胰岛素样生长因子I（GH-IGF-I）轴调控，猪的GH-IGF-I轴与人类有许多相似之处[25]。在胚胎发育过程中，囊胚的形成和上肢芽的出现等关键事件在猪和人的妊娠期同时发生，猪的生长曲线与人相似[26]。猪骨质代谢方面与人有诸多相似，为研究生长激素受体 （GHR）缺陷对人原发性生长激素不敏感综合征（Laron）对骨生长和代谢的影响提供了更好的模型。Cui等利用锌指核酸酶（ZFNs）敲除GHR基因，获得了3种F0杂合子猪（GHR+/4 bp、GHR+/2 bp、GHR+/3 bp），将杂合子猪培育成纯合子（GHR4 bp/4 bp）猪，其体形小，体重减轻。从生物化学角度看，这些猪表现出明显的GH水平升高和IGF-I水平降低，这些结果与在Laron患者身上观察到的表型相似，提示这些猪可以作为Laron综合征疾病的研究模型[27]。

2.4 癌症模型

2.4.1 乳腺癌模型 乳腺癌相关基因1（BRCA1）变异与乳腺癌发生、发展和治疗密切相关[28]。BRCA1是肿瘤抑制因子，在DNA断裂的同源修复中发挥重要作用。BRCA1的突变导致基因组不稳定和癌症易感性[29-30]。年轻人的乳腺癌与BRCA1基因的突变有关[31]。Luo等培育出敲除BRCA1等位基因的尤卡坦小型仔猪，然而所有的小猪在出生后18天内死亡，这些猪早期死亡的原因仍不清楚[32]。

2.4.2 结直肠癌模型 结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见人类癌症，也是截至2018年癌症相关死亡的第二大原因[33]。并且结直肠癌发病率呈现年轻化趋势[34-35]。结直肠癌起源于结肠和直肠的上皮衬里，抑制肿瘤的腺瘤样结肠息肉蛋白（adenomatous polyposis coil, APC）的功能破坏是引发腺瘤性息肉形成的主要事件，APC作为Wnt通路的负调控因子，丢失或功能障碍导致Wnt信号异常，从而导致增殖和肿瘤形成的增加[36-37]。已经产生携带内源性猪APC基因1311位（APC1311）翻译停止密码子的猪，该密码子与导致严重家族腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis, FAP）的人类APC1309突变同源。APC1311/+猪在1年内出现结肠和直肠息肉，表现为典型的人类腺瘤癌序列，如异常隐窝病灶、高级别瘤变和原位癌等。猪腺瘤表现出人类FAP和散发性CRC的遗传和生化特征。从APC1311这样的单一突变启动癌前肿瘤的一个重要优势是可以详细跟踪导致癌症的后续自发事件，这在老鼠身上是不可能的[38]。

2.5 色素性视网膜炎（Retinitis pigmentosa, RP）模型

色素性视网膜炎（RP）的特征是光感受器最初的进行性丧失、随后血管和其他细胞层恶化，是一种遗传性、致盲性视网膜疾病[39]。RP患者由于视网膜色素上皮细胞功能逐渐丧失及光感受器进行性凋亡从而导致不可逆的视力损伤。RP小鼠模型由于小鼠和人类之间眼球细胞结构差异，不能完全复制这种疾病。人与鼠眼球的主要区别在于视网膜上感光细胞的数量和分布，尤其是视锥感光细胞，人的视网膜比啮齿动物的视网膜有更多的视锥感光细胞，人眼视网膜的视锥感光细胞主要分布在黄斑区晚期。然而在啮齿类动物的视网膜中，这些细胞均匀地分布在整个视网膜上[40]。猪的视网膜有一个黄斑区域，富含视锥感光细胞，类似于人类的视网膜。猪是再生医学临床研究的理想对象，因为它的眼睛在大小和结构上与人的眼睛相似，外围主要是杆状光感受器，而视觉条纹主要是锥状光感受器，因此，猪是比鼠更好的RP模型。Petters等生产表达突变的视紫红质基因Pro347Leu突变的转基因猪，早期时出现严重的杆状光感受器丢失，最初它们的视锥光感受器相对存活，但这些幸存的视锥光感受器慢慢退化，当转基因猪发育到20个月龄时，只有一层形态异常的视锥光感受器，视锥细胞视网膜电图明显减少[41]。Ross等生产表达人视紫红质P23H突变的转基因猪模型，这些转基因猪在3个月后出现异常暗视和明视的视网膜电图。猪RP模型的这种表型与RP患者的表型相似，为研究RP的发病机制和治疗方法提供了新的工具[42]。

2.6 囊性纤维化病模型

囊性纤维化病（cystic fibrosis, CF）是一种常染色体隐性遗传病，是由编码囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance, CFTR）的基因突变引起的[43]。CF影响多个器官，如胰腺、肠、肝、输精管和肺。肺疾病是导致CF发病和死亡的主要原因。猪的肺与人类相似，已被建立为几种人类肺部疾病状态的模型。Welsh等生产的新生CFTR-/-仔猪表现出肠道病变、胰腺破坏、胆囊异常和早期肝硬化，与人类CF中观察到的情况相似。随着时间的推移，CFTR-/-猪出现了人类CF中肺部疾病的标志性特征。CFTR-/-猪模型复制了人类CF的大部分特征，提示这些CFTR-/-猪对更好地理解CF的发病机制以及开发新的治疗方案具有价值[44]。

3 展望

目前小型猪已有多种用于人类疾病的转基因猪模型问世。与小鼠相比，可用来复制人类疾病的猪模型数量有限。造成这种情况的原因有很多，如成本高、怀孕时间长和性成熟。此外猪的技术方面极大地限制了转基因猪模型的生产。因此，到目前为止，只有少数基因敲除猪模型被实现。鉴于特异性基因修饰新技术的出现，如ZFN、转录激活子样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）、具有长期增殖能力的供体细胞、猪的诱导多能干细胞等，这些新技术使猪的基因修饰比以往更加有效。此外功能基因组学和蛋白质组学有助于分析猪模型在人类疾病模型的生物学和病理学复杂的分子机制。特别是基因组、转录和蛋白质组数据的整合产生的“系统生物学”促进实验动物模型快速发展。未来需要建立实验用小型猪标准化实验室，包括遗传学、实验动物管理学，以及实验的标准化技术和设备。随着特定基因修饰技术和实验室猪标准化技术的进步，不久的将来会产生更多用于人类疾病的猪模型，从而促进人类疾病临床研究和转化医学的发展。