痘病毒编码的蛋白对NF-κB信号通路调控作用研究进展

王宪军，向 华

（西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

NF-κB是机体先天性免疫和获得性免疫的重要核转录因子，对机体免疫系统的调节起关键性作用[1-2]。在病毒感染宿主的初期，病毒诱导宿主细胞NF-κB等信号通路的活化，产生以干扰素（IL）-1α、IL-6和IL-8细胞因子为主的信号分子，调节宿主天然免疫应答。经典的NF-κB信号通路激活方式与天然免疫反应密切相关，即当细胞受病毒感染时，经过细胞质内一系列的信号转导后，最终将信号汇集到IκB激酶复合体（IKK），使其活化，导致IκBα磷酸化，以及泛素化，随后在26s蛋白酶体的作用下IκBα发生降解，从而导致NF-κB的释放。

尽管病毒的感染能引起宿主的免疫应答，但目前研究已证实，在感染哺乳动物的病毒中，痘病毒科、黄病毒科、疱疹病毒科、非洲猪瘟病毒科、呼肠孤病毒科和布尼病毒科家族等病毒拥有NF-κB活性的抑制剂，存在抑制NF-κB信号通路的现象[3-5]。痘病毒是目前已知基因序列大、复杂及宿主谱广的病毒[6]，具有独特的调节宿主各种免疫应答过程的能力，特别是痘病毒编码的蛋白对NF-κB信号转导系统进行调控，有利于病毒在宿主细胞内复制，进而逃逸宿主的免疫应答[7-8]。尽管在痘病毒科属疾病防控中出现了一些有力的、典型的免疫反应方面抗病毒的药物，但正由于痘病毒存在逃逸宿主的免疫应答的能力，导致病毒不断地逃逸免疫保护，如在实际生产中羊群出现反复感染病毒的现象。因此探索痘病毒科编码的蛋白调节NF-κB信号通路的机制已成为目前痘病毒研究的热点。本研究主要综述近些年痘病毒编码的蛋白通过不同的途径调节NF-κB信号通路的调控作用，为进一步对宿主细胞早期抗病毒的免疫应答方面的研究奠定基础。

1 NF-κB信号通路及其调控机体天然免疫应答的作用

在病毒感染宿主的初期，病毒诱导宿主细胞NF-κB等信号通路的活化，产生以细胞因子为主的信号分子，调节宿主天然免疫应答。宿主细胞利用自身分泌的Ⅰ型干扰素IFNs（IFN-α和IFN-β）干扰病毒的复制。然而，病毒快速地进化出独特的致病机理，削弱宿主细胞天然抗病毒免疫，特别是针对在机体天然免疫早期起重要作用的NF-κB信号通路的抑制作用[9]。

NF-κB是一种广泛存在于多种真核细胞的核转录因子，调控细胞一系列基因的表达，进而影响机体先天免疫和获得性免疫、细胞应激反应、细胞黏附、以及细胞凋亡和增殖[10-11]。哺乳动物细胞内，NF-κB家族由NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB和c-Rel 5种相关联的转录因子组成[12]，通常以二聚体的形式存在于细胞内，不同的二聚体识别特异DNA调控基因的转录。RelA（p65）、RelB和c-Rel蛋白的N端为Rel同源结构域（RHD），对二聚体的形成和DNA的结合发挥作用，而C端为调节转录的活性区域。NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）分别作为p105和p100的前体蛋白，N端为Rel同源结构域（RHD），C端为锚蛋白重复序列区，对泛素依赖的蛋白酶解加工发挥着作用。NF-κB常见的组成形式是p50/p65异二聚体。大部分细胞质内，IκB蛋白通过其N端的锚蛋白重复序列区与p50/p65异二聚体相结合，形成IκBα/p65/p50复合体，遮挡了NF-κB的核定位序列，从而导致NF-κB以非活性的形式存在于细胞质内[13]。

NF-κB信号通路的活化是一个复杂的过程，且受多种刺激的影响，如细菌、病毒、细胞因子、DNA损伤、氧化应激和辐射等[14]。目前对于NF-κB信号通路活化机制的研究已在人[15]、猪[16]、鼠[17]、兔[18]、牛[19]和羊[20]等物种中证实，且具有高度的物种保守性。NF-κB的激活途径主要分经典途径和非经典途径，经典途径的激活方式与天然免疫反应密切相关，即当细胞受病毒感染或其他促炎介质刺激时，经过细胞质内一系列的信号转导后，最终将信号汇集到IκB激酶复合体（IKK），使其活化，导致IκBα磷酸化（在IκBα的Ser32、Ser36），随后磷酸化的IκBα被泛素化，即在含有F-box结构域的泛素连接酶复合物SCF（SkpI-Cull-FBP）作用下使IκBα的Lys21和Lys22上发生泛素化，随后在26s蛋白酶体的作用下IκBα发生降解，从而导致NF-κB的释放[21-22]。同时IKK也存在负调控的作用，主要是IKKβ上C端丝氨酸的磷酸化作用，从而抑制NF-κB信号通路的活化[23]。随着NF-κB释放到细胞核后，其连接到一个DNA共有序列5'-GGGACTTTCC-3'（κB成分），随后在细胞核内启动第二水平的转录活性调控，主要包括NF-κB的磷酸化和乙酰化作用，即RelA在蛋白激酶A（PKA）的作用下发生磷酸化，从而促进NF-κB与转录因子CBP/p300的结合，有力地增强基因的反式激活作用。同时，糖原合成酶激酶（GSK-3β）对于NF-κB转录活性的调节也具有作用，而NF-κB直接或可逆的乙酰化被描述作为NF-κB活性额外的调节机制作用[24]。在NF-κB通路非经典途径中，NF-κB2（p100）与RelB形成异源二聚体，当细胞受到淋巴毒素β受体（LTβR）、肿瘤坏死因子家族的B细胞活化因子（BAFF）、CD40配体等因子刺激时，p100的C端两个位点磷酸化依赖的泛素化降解后加工成p52，一旦降解，p52的N端被释放，导致p52-RelB二聚体的细胞核移位，启动靶基因转录和表达[25]。

阻碍NF-κB信号通路活化的病毒抑制剂分为两类：一种为病毒分泌的配体，通过与可溶性的病毒受体或者细胞因子的相互作用来阻碍NF-κB活化信号的启动；另一种是细胞内存在的NF-κB抑制剂，主要为病毒编码的蛋白，这些蛋白往往存在锚蛋白重复序列（ankyrinrepeat,ANKs）和PYD域NF-κB抑制剂，在细胞内影响NF-κB信号通路[4]。

2 痘病毒编码的蛋白对NF-κB信号通路的调控作用

抑制细胞内NF-κB活性的功能已在痘病毒家族内存在，且NF-κB信号通路是痘病毒家族抑制和逃避宿主免疫应答的主要靶点[26-27]。阻碍NF-κB信号通路活化的痘病毒抑制剂同样包括病毒分泌的配体和细胞内存在的NF-κB抑制剂，即病毒编码的蛋白。例如，黏液瘤病毒（Myxoma virus,MYXV）分泌的可溶性T2蛋白，在1991年首次被鉴定为细胞因子TNF的受体（vTNFR），T2蛋白与TNF结合后抑制了宿主细胞质内NF-κB的激活[28]。天花病毒（Variola,VARV）、猴痘病毒（Monkeypow virus,MPXV）和猪痘病毒（Swinepox virus）编码一种能与IL-18结合的蛋白，通过阻止NF-κB的激活来调节宿主的抗病毒能力[29]。细胞内存在的NF-κB抑制剂，即病毒编码的蛋白主要通过以下4种途径抑制NF-κB信号通路。

2.1 抑制依赖宿主细胞内Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）介导的NF-κB的激活

如痘苗病毒（Vaccinia virus,VACV）编码的蛋白A46和A52，两者与TIR的胞浆内结构域具有氨基酸序列相似性。研究已证实，A52能通过TLR家族成员，包括IL-1R、IL-18R、TLR4和TLR3的调节作用，使得A52与IRAK2和TRAF6的结合，从而抑制转录因子NF-κB的活化[30-31]。A46蛋白通过结合承接分子MyD88、MAL、TRIF和TRAM等蛋白阻止TIR结构域和承接分子之间的相互作用，从而干扰下游MAPK和NF-κB的激活[32]。羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）编码的002蛋白通过抑制MSK1介导的NF-κB p65 Ser276的磷酸化，从而抑制NF-κB的转录活性[33]。VACA编码的蛋白A52和K7能与肿瘤坏死因子受体相关分子6（TNF receptor-associated factor 6,TRAF6）相互作用，抑制其激酶活化，间接抑制NF-κB的激活[34]。

2.2 病毒编码的蛋白通过与IKK复合物发生直接或间接的相互作用来抑制NF-κB信号通路

研究报道，VACV编码的蛋白N1L能通过与IKKα、IKKβ、IKKγ、TBK1之间发生直接的相互作用，从而抑制NF-κB信号通路的活化[35]。传染性软疣病毒（Molluscum contagiosum virus,MCV）编码的蛋白MC160，通过与Hsp90和蛋白酶-8的结合，抑制Hsp90与IKKα之间的相互作用，从而降低IKKα的稳定性，抑制NF-κB活性[36]。2008年Chen等研究发现，VACV编码的蛋白B14R，能通过特异性地与IKKβ相互作用，抑制IKKβ的Ser177和Ser181发生磷酸化，从而抑制NF-κB的活化[37]。VACV编码的锚蛋白K1L可通过抑制IκBα的降解从而阻断兔肾细胞（RK-13）TLR2、TLR4和TLR9介导的NF-κB信号通路[38]。在病毒感染的早期，ORFV 119基因编码的蛋白以依赖视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein,pRb）抑制IκB激酶（IκB kinase,IKK）复合物的激活，从而抑制NF-κB信号通路[39]。ORFV073与MCV编码的蛋白MC005都可通过与IKK亚基NEMO结合来抑制IKK复合物的活性，从而抑制NF-κB信号通路[40-41]。VACA编码的蛋白B15，可通过与IKK复合物的结合抑制IκBα的磷酸化和降解。

2.3 病毒编码的蛋白通过与SCFβ-TrCP复合物的相互作用来抑制NF-κB的活化

例如，VARV编码的蛋白G1R，VACV编码的蛋白CP77，其C末端的F-box样结构域与SCF复合物中的Skp1蛋白结合而阻止IκBα蛋白磷酸-泛素化降解而抑制NF-κB的活化[42-43]。

2.4 与转录因子NF-κB的相互作用来影响NF-κB的信号通路

VACV编码的CP77蛋白通过其末端的6个ANK重复基序以及C末端的F-Box样结构域共同结合NF-κB-p65而抑制NF-κB信号转导活性[44]；MYXV编码的蛋白M150，被认为是黏液瘤核转录因子（MNF），含有与IκBα的核定位信号序列（ANK重复序列）相似性，已显示该蛋白与p65具有共区域化，从而削弱了p65的转录活性以及负向的调控依赖NF-κB活化信号因子的产生[45]。MCV编码的M150R蛋白可通过其第8个ANK基序干扰NF-κB的核转移，进而影响其免疫调控活性[46]。在细胞浆，ORFV 121基因编码的NF-κB抑制剂能和NF-κB-p65 发生物理性结合，抑制NF-κB-p65的磷酸化和核转运，从而阻止了免疫相关基因的转录和翻译[47]。

3 具有多个多锚蛋白重复（ANKs）基序的锚蛋白参与NF-κB信号通路调控的作用及展望

锚蛋白重复序列（ankyrin repeat,ANKs）是普遍存在于生物体中的一种由33个氨基酸残基基序组成的蛋白质序列模体，由两个α螺旋和一个loop区构成，在细胞信号转导、细胞骨架完整性、细胞周期调控、免疫应答、蛋白转运等过程中均具有重要作用[48]。ANKs不仅存在于生物体，也存在于痘病毒编码的蛋白，而其他病毒几乎不编码锚蛋白。锚蛋白作为痘病毒编码的蛋白中最大的家族，其特征是具有ANKs的N末端和1个F-Box样的C末端结构域[49-51]。已有研究报道，与痘病毒编码的蛋白相似，锚蛋白可通过多层次的方式来影响NF-κB信号通路。

例如，VARV编码的蛋白G1R，VACV编码的蛋白CP77，两者均可通过其N端的ANK重复基序，分别与NF-κB1/p105，NF-κB p65蛋白直接或间接结合抑制宿主NF-κB的活化[42-43，52]。2014年Lamb等发现，MYXV编码的锚蛋白M-T5、M148R、M149R和M150R均能抑制NF-κB p65蛋白从细胞质迁移到细胞核，减少细胞核内NF-κB p65的聚集，抑制或者降低NF-κB信号通路的活性[53]。同样VACV编码的蛋白K1L可通过对NF-κB信号途径不同位点的作用而调控宿主的天然抗病毒免疫应答[54]。对牛痘（Cowpox virus）ANK重复蛋白cpxv-006功能作用的敲除研究表明，cpxv-006突变体能够诱导NF-κB p105亚单位的降解，这对NF-κB活性的调节有明显的影响[43]。ORFV编码5个结构相似的锚蛋白，即ORF008、ORF123、ORF126、ORF128和ORF129，它们都具有个数不等的ANK基序和1个F-box-like结构域[55]。对于ORFV编码的5种锚蛋白，ORF008、ORF123能阻止经TNF-α刺激NF-κB活化后IκBα蛋白磷酸化降解过程并能抑制NF-κB p65蛋白核移位，而影响NF-κB信号转导途径[56]。ORF128蛋白在病毒感染早期表达且定位于宿主的细胞核，通过抑制IκBα蛋白磷酸化降解过程，阻止NF-κB p65蛋白核移位，进而抑制宿主NF-κB信号通路的活化[57]。ORF126蛋白表达后靶向定位于线粒体内，且ORF126编码的AR8和AR9对锚蛋白定位于线粒体内起着关键性的作用，对于ORF126蛋白的功能目前不清楚，仍需进一步研究[48]。ORF129含有6个ANK基序的N末端和1个F-Box样的C末端结构域，由此推测ORFV编码的ORF129蛋白也可能通过抑制NF-κB p65和SCF、E3泛素连接酶复合物，阻止NF-κB迁移至细胞核，以逃避宿主的天然免疫应答[58]。因此，痘病毒编码的蛋白，特别是痘病毒内具有ANKs基序的锚蛋白，可能通过对NF-κB信号途径的不同位点的作用而调控宿主的天然抗病毒免疫应答，这也是丰富痘病毒感染宿主细胞的致病机理方面研究发展的方向。

4 小结

痘病毒编码的蛋白通过影响与宿主天然免疫密切相关的NF-κB信号通路，有利于病毒在宿主细胞内的复制，导致病毒不断地逃逸免疫保护而出现病毒的反复感染。因此，探索痘病毒编码的蛋白调节NF-κB信号通路的机制已成为目前该科病毒属研究的方向，将为进一步阐明NF-κB信号通路对病毒感染的反应、识别该途径的关键环节，从而开发针对该靶点潜在的治疗药物，以及疫苗候选株的培育提供科学依据。