肾阳虚证阳痿模型研究进展

许家耀 郭江鑫 黄丹妮 覃秋韵 张红参

【摘要】近年来关于肾阳虚证阳痿的病因、病理的研究基础大多基于动物实验，筛选出符合中医证候的动物模型有利于深入研究肾阳虚阳痿本质及治疗方案。目前已知的动物模型可分为中医传统病因模型和西医病理模型，模型间各有优劣，且验证动物勃起障碍的检测技术及评价方法尚未达成一致，因此归纳总结现有方法的优劣对模型动物的选择具有一定的指导意义，使得实验成果更适用、惠及人类。本文就各类型肾阳虚阳痿动物模型的构建及验证作一综述。

【关键词】肾阳虚证;阳痿;动物模型;研究进展

基金项目：1.2020年大学生创新创业训练计划项目：壮医药线鲜花叶透穴灸疗法干预肾阳虚型阳痿小鼠的实验研究;2.2021年大学生创新创业训练计划项目：壮医鲜花叶透穴灸疗法调控肾阳虚型阳痿大鼠S1P通路的分子表达机制;3.2021年大学生创新创业训练计划项目：民族医学知识产权孵化平台。

目前肾阳虚证动物模型的研制涉及中医病因学、病理、分子生物学等多个领域，笔者将对常用模型的证候生物学机制进行简单的叙述和讨论，纳入当前一些造模的改进方法，从病因和病理两方面，以及肾阳虚阳痿模型的相关检测指标进行总结，并对目前所存在的问题进行阐述，以评价适宜中医证型、实验应用的阳痿模型，旨在为肾阳虚证阳痿的深入研究提供一定依据。

1.中医传统病因模型

1.1恐伤肾阳痿模型

《素问·举痛论》曰：“恐则气下，惊则气乱”，恐为肾志，恐而精下，恐则精却，恐惧过度可致肾精亏虚，气机紊乱，导致肾藏精，主纳气功能失衡，进而出现阳痿、遗精等证候。沈氏首创“猫吓鼠”“人吓猫”及“鞭炮吓狗”方法，研究发现惊恐可造成实验动物睾丸、垂体、肝脏等部分腺体和脏器不同程度的损伤。但单一“猫吓鼠”法随实验延长，猫会因长时间捕获失败而趋于平静，小鼠所受刺激也相应减弱，进而影响实验效果，且每天需供1只老鼠喂猫，增加了实验成本。据此特点，实验动物应尽量采取复合法造模。如采用心理应激、束缚、尾悬挂、站台、夹尾搏斗五种应激模式依次安排7周内，能够较好地模拟外界环境，并得到了研究者们的普遍认可。

1.2劳倦过度、房劳伤肾阳痿模型

肾主生殖，房事过度，耗损肾精，日久则致阴缺阳损，精气不足，阳痿不举。闫氏将实验组雄鼠并置于30℃水中游至力竭后，每日每只雄鼠按1：6同笼于发情期雌鼠，迫使交配过度，连续42d。随时间延长，出现了生殖机能低下为主要表现的肾阳虚证，下丘脑—垂体—性腺轴（HPG轴）中GnRH、LH、FSH、T等下降显著，且乳酸脱氢酶（LDH-x）活性明显下降，同期研究表明下丘脑—垂体—肾上腺轴、甲状腺轴损伤也符合公认的肾阳虚证病理改变。

1.3老年肾虚阳痿模型

中医古代医家认为肾脏精气直接影响人的生殖能力，《素问·上古天真论》：“丈夫，……七八，肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极。”言明男子50岁以后，肾精亏虚或肾阳匮乏，往往导致性功能异常，出现阳痿。在传统病因模型中，老龄阳痿大鼠最接近人的发病状态，且能降低因糖尿病、高血压，AS等慢性病所致ED的干扰效果，因此研究者大多选用区间18-20月龄的老龄大鼠。

2.西医病理模型

2.1药物干预

2.1.1糖皮质激素阳痿模型

氢化可的松动物模型是目前最常用的制造方法，原理在于氢化可的松使得垂体ATCH释放减少，转而抑制类固醇激素的释放，个体稳态改变。林氏从行为学实验进行了深入研究，氢化可的松造模结束后小鼠出现拱背、蜷曲、体重增长减缓、畏寒肢冷、游泳存活率下降、交配能力减弱等“耗竭”现象;吕氏对SD大鼠按40mg/kg剂量连续21d肌注氢化可地松，模型组勃起率及勃起次数明显下降，符合肾阳虚征阳痿证候，且模型组T、E2、T3、T4、ATCH的低水平表达，提示了下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）、甲状腺（HPT）、性腺（HPG）轴不同程度的功能紊乱，靶腺轴激素的下调将影响阴茎血管收缩信号，进而导致阳痿。

2.1.2羟基脲阳痿模型

羟基脲（Hu）可造成大鼠下丘脑-垂体-靶腺轴（肾上腺、甲状腺、性腺）不同程度的功能紊乱，出现一系列阴损阳虚症状。段氏配制羟基脲水溶液，375mg/kg·d剂量灌胃SD大鼠，连续17d，大鼠外在表现和行为实验结果显示与肾阳虚相吻合，但肾上腺改变不明显，睾丸减轻，T/E2下调显著，因此可推断羟基脲损伤性腺轴先是肾上腺轴，具有明显的抑制作用，这可能与抑制睾丸细胞DNA合成，性激素水平降低密切相关，通过性腺轴对垂体的损害，进而影响其他腺体功能，最终导致性功能低下。

2.1.3苯甲酸雌二醇阳痿模型

Chen等对ICR小鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇（EB），剂量4mg/kg，15d后，小鼠出现一系列肾阳虚体征（体重下降、肛温降低、力量减弱、运动能力下降等），提示造模成功。经治疗后Chen发现除肾上腺外，精囊和睾丸OBI（脏器-体重指数）不能完全恢复正常水平，提示造模药物对性腺轴较为敏感。苏氏采用雄性SD大鼠腹腔注射EB（2mg/kg）连续10d，模型鼠GnRH、FSH、LH、T、E2改变显著，当药量加至5mg/kg时，HE染色显示生精小管罕见精子存活。

2.1.4氨基导眠能阳痿模型

氨基导眠能（AG）为3β-脱氢酶及11β-羟化酶的阻滞剂，能抑制胆固醇向孕烯醇酮的转化，进而阻滞肾上腺甾体激素的合成与降解代谢，通过AG灌胃Wistar大鼠10mg/只，持续7周，使得动物肾上腺萎缩、减轻，雄激素，皮质醇分泌减少，交配能力减弱，可构建符合下丘脑-垂体-肾上腺、性腺轴衰退的肾阳虚阳痿模型。

2.1.5腺嘌呤阳痿模型

作为使用率仅次于氢化可的松模型的造模方法，当机体摄入大剂量腺嘌呤时，高水平的腺嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下会转变成极难溶解的2，8-羟基腺嘌呤，堆积于肾小管与肾间质部位，阻塞肾小管，出现“大白肾”现象，腺嘌呤代谢产物的毒性作用诱发三大营养物质代谢障碍，能量代谢失衡使得HPA、HPT、HPG三軸失衡低下，进而损伤肾脏和翠丸生殖细胞及间质细胞，模型动物呈肾阳虚阳痿表现。回顾研究发现，腺嘌呤难溶于水，给药剂量难以统一，为保证模型稳定性和成功率，造模周期往往长达一月之久。随着研究深入，贾氏加入阿拉伯胶作为助溶剂进行改良，以50mg/（kg·d）剂量，灌胃12d后，大鼠出现“大白肾”现象，且损伤呈不可逆性改变，学者[16]们按50-100mg/（100g·d）剂量持续灌胃10-20d，可造成大鼠渐重性的生殖损伤，并发勃起障碍。

2.1.6雷公藤多甙阳痿模型

中药雷公藤具有抗炎、抗肿瘤及抗生育等药理作用，其提取物雷公藤多甙片被广泛应用于临床和实验研究中，有学者连续30d按20mg/kg剂量，模型大鼠表现出蜷缩、精神萎靡、畏寒肢冷，生殖功能低下等肾阳虚体征，IHC显示生殖腺NOS表达减少，这将影响NO生成，细胞外Ca+内流增加，阴茎血管收缩，血流减少，ED发生率大大增加。

2.1.7硫脲类阳痿模型

硫脲类药物（他巴唑、丙基硫氧嘧啶、甲基硫氧嘧啶）能有效抑制HPT轴，与丙基硫氧嘧啶、甲基硫氧嘧啶相比，他巴唑副作用最小，单日大剂量给药不良反应少，成模效果佳，稳定性好，应用广泛，常用于构建甲功低下型肾阳虚模型。

2.2手术干预

2.2.1肾上腺去势阳痿模型

通过手术次全切或双侧全切肾上腺，随着大鼠肾阳虚证愈发明显，ED风险增加显著，其机制较为复杂。以雄激素为例，大鼠阴茎勃起具有雄激素依赖性，去势法在抑制HPA轴的同时也切断了HPG轴的反馈途径，T下降幅度次全切低于全切且实验证明动物阴茎NOS蛋白的表达明显减少，NO/cGMP通路阻滞，对性刺激减敏，最终引发阳痿。

2.2.2甲状腺去势阳痿模型

经手术切除甲状腺的大鼠可表现畏寒、肢冷、性欲低下等肾阳虚阳痿体征，研究发现去势模型普遍表现出勃起障碍，虽然HPT轴的变化会导致HPA轴发生偏差，但其影响机制目前尚不清楚。

2.2.3性腺去势阳痿模型

根据“肾藏精，主生殖”理论，生殖损伤作为肾阳虚证的一个重要体征，人为去除大鼠双侧睾丸能够模拟出性器官发育异常、精子质量下降、勃起次数下降等生殖损伤。虽然体内睾酮仍可由肾上腺分泌，但占比不大（5%），因此不建议药物的反证试验。

3.肾阳虚证阳痿的评价方法

3.1肾阳虚证

3.1.1症状

模型动物可见体重下降、体温降低、毛稀疏、大便稀溏、小便增多、反应迟钝、自主活动减少、畏寒怕冷、游泳时间及耐冻能力明显降低。

3.1.2生化指标

血浆环磷酸腺苷含量相对降低，环磷酸鸟苷含量相对升高;T3、T4降低，TSH含量升高，ACTH含量降低，血清皮质醇浓度降低;T含量降低，E2含量降低等。

3.2 阳痿

3.2.1 交配试验

作为现阶段评价阳痿的最常用试验之一，交配实验是将药物诱导的发情期雌鼠与实验雄鼠放置同一笼子内，保持环境安静，光暗适中，借雄鼠爬跨、射精次数及射精潜伏期等指标评价勃起功能。

3.2.2 阿扑吗啡（APO）试验

阿扑吗啡能够激活多巴胺D1、D2受体，诱发实验大鼠产生阴茎勃起。鉴于其近100%的勃起成功率，学者们常选用80μg/kgAPO皮下注射于实验动物颈部，观察30min内大鼠的勃起次数，进而筛选阳痿模型。

3.3.3 阴茎海绵体内压（ICP）测定

通过手术暴露阴茎海绵体组织，穿刺针进入左侧海绵体窦，并连接压力感受器;电刺激L5-S2脊髓节段诱发阴茎勃起，借助换能器测定阴茎海绵体内压（ICP）。

4.讨论

本文综述了近20年相关阳虚证阳痿动物模型的文献，西医病理模型居多，其中又以糖皮质激素与腺嘌呤模型最为常见，而其他病理模型因针对性研究较少，缺乏成熟的理论支持，故其应用价值尚待进一步考证。

虽然药物干预以其简、便、廉、验的优势被学者们大量引用。但也存在一些问题：①单一性。药物多数只能反应临床肾阳虚的某一病理变化，如氢化可的松模型主要损伤肾上腺轴，羟基脲、苯甲酸雌二醇以及腺嘌呤主要损伤性腺轴，硫脲类主要损伤甲状腺轴。而肾阳虚征涉及多个轴的紊乱，药物的单一性使得动物模型的构建存在一定的局限性。②难溶性。类似于羟基脲、腺嘌呤等不易溶于水的药物，则不能保证动物达成统一的模型效果，虽然可加入相关助溶剂，其助溶效果以及是否具备可行性往往需要进一步验证说明，这就导致大多建模剂量和给药时间因研究者不同而出现差异。③副作用。羟基脲可引起动物骨质疏松等病理改变，腺嘌呤导致大鼠出现不可逆的“大白肾”损伤，雷公藤制剂具有明显的生殖蓄积毒性，这些药物的副作用导致的个体差异对实验结果的影响不可忽视。④不规范。雷公藤制剂目前尚未统一标准剂量与时相，造模周期长且死亡率达40%以上，实验成本较高等诸多弊端使得该法可行性较低。硫脲类目前只能模拟出甲状腺轴的异常，对肾上腺、性腺轴影响不大。

手术去势法中甲状腺去势可用于排除TH干预的特定阳痿实验研究，但是，此法对操作要求较高，且死亡率较高，增加了实验成本，能否作为理想的肾阳虚阳痿模型还有待于进一步考察。性腺去势诱导阳痿成功率最高，但研究表明睾丸切除术使得HPA軸对ATCH、CORH的反应性上调，与一些学者的结论相悖[23]，针对性腺去势阳痿模型是否应该纳入肾阳虚征范畴，有待于学者们进一步讨论研究。肾上腺去势手术创伤大，工序繁琐，术后恢复过长（30天），该法应用较少。这三种方法往往造成反馈平衡失调致动物内分泌水平与临床肾阳虚患者差异明显，且靶腺缺如不利于药物反证，总体而言采用率不如药物干预。

传统中医模型更契合中医病因病机，符合因果关系论，但因方法不同，各模型之间存在诸多问题：①恐伤肾。成本高，过程繁琐，量产不宜。②房劳伤肾。需要耗费与实验雄鼠数倍的雌鼠协助建模，以保证同笼交配实验效果，而且小鼠的性活动作为一种自主行为，难以控制，因此造模标准欠佳。③老年肾虚。造模时间长达1年之久，可操作性低，发情休息期与衰老期界限不明显，故限制了该模型的应用。

综上所述，现有的造模法既有优点，又有缺点，因此根据实验目的确定更符合临床证候的动物模型至关重要。模型既要满足中医肾阳虚的特色，还要满足公认的病理生理指标，目前常用的判断指标有观察动物的形态表现、肾上腺、性腺和甲状腺功能状态、能量代谢等指标，并且阳痿作为肾阳虚证的一个证候，如何进行有效精准的评价是研究顺利开展的前提。交配实验施行简便，但大鼠易受外周环境的影响，受惊而中断交配，造成正常大鼠假阳性结果。APO勃起实验虽然简易，但易受观察者主观影响，不同观察者间可能造成结果差异。阴茎海绵体内压测定凭其标准化以及科学化可作为评价和筛选阳痿模型的主要手段，已经得到学术界的普遍认可，但操作要求较高，所带来的创伤隐患不利于药物的疗效验证。由此可见，筛选符合临床指征的动物绝非易事，如何构建符合中医病因、病性、病理概述，还要减少药物反证影响因素的肾阳虚阳痿模型，仍需要广大学者继续探索，以便更好应用于中医药研究的各个领域。

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