桂林市首次在健康人群中检出１株硫化氢阳性甲型副伤寒的实验室报告

刘志冰 郭昕 蒋立立

【摘要】目的：防止漏检硫化氢阳性甲型副伤寒菌株。方法：2019年2月在一食品从业人员肛拭标本中检出1株甲型副伤寒沙门菌，用SC增菌液增菌，沙门菌显色培养基分离，对菌株进行系统生化、血清学试验，RT-PCR技术进行确认。结果：分离培养、生化特性、血清学试验均符合甲型副伤寒沙门菌特性，硫化氢阳性。经微量生化等系统鉴定为1株硫化氢阳性的甲型副伤寒菌。结论：必须注意鉴别硫化氢阳性的甲型副伤寒菌。

【关键词】甲型副伤寒菌;硫化氢阳性

基金項目：广西桂林市科技局项目（NO.20190602-2）

【Abstract】Objective：to prevent the detection of H2S positive paratyphoid strain. Methods：1 strains of Salmonella paratyphi A were detected in a food worker's anal swab in February 2017. The bacteria were increased by SC bacteria， and the Salmonella color culture medium was separated. The biochemical and serological tests of the strains were carried out. The RT-PCR technique was used to confirm the separation and culture， the biochemical characteristics and the serological test. Salmonella paratyphi A is characteristic of hydrogen sulfide. 1 strains of Salmonella paratyphi positive were identified by microbiological system. Conclusion： we should pay attention to distinguishing paratyphoid A from H2S positive.

【Key words】paratyphoid A; hydrogen sulfide positive

 伤寒、副伤寒是《中华人民共和国传染病防治法《 规定的乙类传染病，传染性强、病程长、易复发、并发 症多、疾病负担重，是发展中国家面临的公共卫生问题之一。桂林市伤寒、副伤寒发病率一直在广西名列前茅，于20世纪80年代为最高峰，之后开始逐渐下降，呈散发状态，并稳定在一定水平。

2019年2月，桂林市疾病预防控制中心检验科病原微生物室从健康体检人员肛拭子标本中分离到1株产硫化氢的A群沙门菌，经生化检验，血清凝集，细菌核酸测定，鉴定为甲型副伤寒，现将实验结果报告如下：

1 材料与方法

1.1菌株来源：由桂林市疾病预防控制中心病源微生物检验室从食品从业人员健康体检的肛拭标本中检出。

1.2 材料 SC增菌液、克氏三糖铁琼脂，XLD培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司;沙门菌显色培养基和沙门菌诱导培养基均购自科玛嘉生物科技有限公司;沙门菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司和丹麦血清;ID32E生化试验条购自上海星佰科技有限公司。BIO-CFX96荧光PCR仪，伤寒，副伤寒沙门菌检测试剂盒购自深圳生科原生物科技有限公司，上述实验材料均在有效期内使用。

1.3 方法 按照《从业人员预防性健康检查沙门菌，志贺菌检验方法》（WS/T458-2014）进行试验。

2 标本检测

2.1 细菌分离  将健康体检人员肛拭子标本接种至SC增菌液中，37℃培养18 h～ 24 h， 划线分离到沙门菌显色培养基以及XLD平板上， 37℃培养18 h～ 24 h后，在沙门菌显色培养基上挑取表面光滑湿润，紫红色，中等大小的圆形菌落及XLD平板上挑取圆形边缘整齐，红色半透明，表面光滑湿润，中心呈黑色或无色菌落转种三糖铁培养基上， 经37℃培养24 h， 三糖铁管呈现葡萄糖产酸产气， 乳糖不分解， 划线上产生少量H2 S， 动力+。同时，将其转种到血平板上，培养18 h～ 24 h。

2.2 生化鉴定   挑取血平板上菌落调成0.5麦氏当量菌液， 按厂家说明书程序接种于ID32E生化试验条上，37℃24小时培养后用全自动细菌鉴定系统进行生化鉴定，鉴定结果为甲型副伤寒， 鉴定编号为6704752， 具体结果如下：

阳性结果：赖氨酸脱羧酶， 鸟氨酸脱羧酶， 精氨酸双水解酶， 葡萄糖产酸产气， 柠檬酸钠， 甘露醇， 硫化氢， 肌醇， 山梨醇， 鼠李糖，阿拉伯糖， 蜜二糖， 硝酸盐还原。

阴性结果：氧化酶， ONPG， 尿素， 色氨酸脱氨酶， 吲哚， VP，明胶， 蔗糖， 苦杏仁苷。

2.3 血清学试验： 待测菌与沙门菌属诊断血清凝集 A - S群O 多价呈强凝集（ ++++）， 并与O2呈强凝集（+ ++ +）与 O1呈强凝集（+ ++ +）与O12呈强凝集（+ ++ +），与HMA （a， b， c， d， i， z10， z29） 呈强凝集（+ ++ +），与H a呈强凝集（+ ++ +）.H 因子第二相与诊断血清不凝集。用H a诱导血清经2次位相诱导后， 仍然不凝集。说明H 因子第二相缺失。从而得出其分子型为：2，12：a：- 。根据《沙门氏菌属血清型诊断》中的诊断，符合甲型副伤寒沙门菌定义。

2. 4   核酸鉴定：为了确保准确无误，我们用荧光PCR法进行了甲型副伤寒核酸测定，结果为扩增曲线阳性，CT值为17.74和18.18。

2.4.1核酸提取：在已纯化的营养斜面上挑取适量菌苔加入1毫升无菌生理盐水中，混匀。取200微升加入到核酸提取试剂板中，放至核酸自动提取仪上，按操作说明进行核酸提取。

2.4.2 实时荧光PCR检测   按照生科原甲型副伤寒检测试剂盒上说明设置反应体系，其中反应条件：95℃ 5 min;95℃ 10 s，55℃ 32 s，72℃ 15 s（共40个循环）。在第2个循环周期的55℃ 退火阶段采集FAM通道的荧光数据。设无菌水作为阴性对照。 结果待检样本在荧光通道上与甲型副伤寒沙门菌阳性对照均出现阳性扩增曲线，CT值为17.74和18.18，阳性阳性对照CT值为19.74。

3 结论

根据上述培养特性、生化反应、血清学试验以及核酸测定， 该分离菌符合甲型副伤寒沙门菌定义， 因此该从业人员确定为甲型副伤寒沙门菌带菌者。

4 讨论

4.1 甲型副伤寒是一种常见肠道传染病，可以通过饮水、食物和日常生活接触等方式传播。桂林市地处喀斯特地貌，地下水源丰富，极易引起肠道传染病的发生。近年来随着国家经济的提升，作为国家旅游胜地的桂林市人员流动急剧增加，伤寒副伤寒以及非伤寒沙门菌病例报告呈上升趋势。

4.2  非伤寒沙门菌在桂林市健康人群的检出率在0.6%--2.5%，但伤寒副伤寒在健康人群中的检出却很低，这可能与伤寒副伤寒为胞内寄生菌，通常入血，随血液扩散到全身，用病人的血液做血培养检测甲型副伤寒沙门菌比较容易检出，但症状消失后常寄身在胆囊中，用肛拭子检测难以检测到有关。而在健康人群的肛拭子中检出甲型副伤寒，实属少见，产H2S株就更为罕见，故具有重大意义。

4.3 甲型副伤寒沙门菌在通常情况下不产H2S，实验室工作人员在做产H2S菌株诊断血清凝集时容易忽略O2的凝集.当其他O因子血清都不凝时，容易被当作杂菌而被弃掉。

4.4  由于沙门菌显色培养基成本比较高，基层实验室多选择使用XLD培养基或SS培养基。大多数沙门菌在XLD平板或SS平板上均产H2S而使菌落呈现黑色，在挑取可疑菌落时容易被发现。而甲型副伤寒沙门菌由于不产H2 S而在XLD平板上呈红色半透明菌落，或者在SS平板上呈无色透明菌落，与大肠菌相似，及难分辨。同时在健康体检人群的肛拭标本中，可疑菌落少，杂菌菌落复杂，在XLD培养基或SS平板上挑取可疑菌落时不容易被发现而造成漏检。

因此提醒从事微生物检测的工作人员，在具体检验过程中，要本着实事求是的态度，在遵循一般规律的同时，要考虑特殊菌株的生化特异性，多参考国内外最新资料，不能机械地、一味地按程序检验，注重平时经验和规律的积累，否则易导致漏检或误判。

参考文献：

[1] 林玫， 唐振柱， 董柏青， 等.1993 ～ 2002 年广西伤寒、副伤寒流行特征及防治对策分析〔J〕.华南预防医学， 2006， 30（4）：10 -12.

[2] 朱超，许学斌著.沙门氏菌属血清型诊断.同济大学出版社，2009，7.1

[3] 张振开 黄少新 邓玄 等桂林市15年间伤寒和副伤寒流行特征分析[J]  公共卫生与预防医学 2009，20 [4]：11-13

[4] 刘志冰 . 两种检测方法对肠道沙门菌的检测结果比较[J].華夏医学、2017.30（3）：106-10

[5] 陈益明  44 株甲型门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J]  浙江预防医学  2000，12[ 7];3-6

作者简介：刘志冰（1966-），女，广西富川县人，主管检验技师，主要从事病原微生物检验工作.