梅州沙田柚苦涩味与施用硫酸钾镁相关性研究

丘苑新 朱凯祺 马路凯 莫娟娟 钟永辉 柳建良

摘要 [目的]研究施用硫酸钾镁肥料后沙田柚苦味增加的因素，为梅州沙田柚的种植和栽培提供指导，提高梅州沙田柚产业的质量。[方法]以硫酸钾镁肥料施肥种植的梅州沙田柚为原料，通过相关性分析方法分析柚子苦味增加的因素。采用高效液相色谱法测定柚子的柚皮苷和柠檬苦素2种苦味物质的含量，对镁离子、氯离子和总硫这3种影响因素含量与感官评价进行相关性分析。[结果]感官评价与柠檬苦素之间呈极显著正相关（P<0.01），与柚皮苷之间的相关性不显著。柠檬苦素与镁离子之间呈极显著相关性（P<0.01），而与氯离子和总硫含量相关性不显著。反映出施用硫酸钾镁肥料会使得柚子镁离子含量增高，从而使得柚子中的柠檬苦素含量增加，造成梅州沙田柚苦味增加。[结论]在梅州地区施用硫酸钾镁肥料会使柚子的苦味增加，影响品质。

关键词 高效液相色谱（HPLC）;沙田柚;柚皮苷;柠檬苦素;相关性分析

中图分类号 S 666.3  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）20-0064-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.018

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Correlation between the Bitterness and Mg，S，and Cl  Element of Meizhou Shatian Pomelo

QIU Yuan-xin，ZHU Kai-qi，MA Lu-kai et al （Department of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou，Guangdong  510220）

Abstract [Objective]In order to provide guidance for planting and cultivation of Shatian pomelo and improve the quality of Shatian pomelo industry in Meizhou，the factors of bitterness increase of Shatian pomelo after applying potassium magnesium sulfate fertilizer were studied.[Method]Using Meizhou Shatian pomelo，which was fertilized with potassium magnesium sulfate fertilizer，as raw material，the factors that increased the bitterness of pomelo were analyzed by correlation analysis.The contents of naringin and limonin in grapefruit were determined by HIGH performance liquid chromatography.The correlation between the contents of magnesium ion，chloride ion and total sulfur and sensory evaluation was analyzed.[Result]Sensory evaluation had a very significant positive correlation with limonin（P<0.01），while had no significant correlation with naringin.Limonin had a very significant positive correlation with magnesium ions （P<0.01），had a significant positive correlation with chloride ions （P<0.05），and had no significant correlation with total sulfur content.It could be reflected that the application of potassium magnesium sulfate fertilizer would increase the content of magnesium ion and chloride ion in grapefruit，which would increase the content of limonin in grapefruit，increase the bitterness of Meizhou Shatian pomelo.[Conclusion]The application of potassium magnesium sulfate in Meizhou area increased the bitterness and affected the quality of grapefruit.

Key words High performance liquid chromatography（HPLC）;Shatian pomelo;Naringin;Limonin;Correlation analysis

作者簡介 丘苑新（1960—），男，广东兴宁人，副教授，博士，从事果蔬天然产物研究。

收稿日期 2021-01-20

沙田柚是柚子的一种，属于芸香科柑橘属，与柑橘、柠檬有相似之处[1-2]。沙田柚是梅州的一大经济作物，也是广东的一大特色水果[3]。柚子果肉中含有的黄酮类化合物（柚皮苷）和三萜类化合物（柠檬苦素）是其主要的苦味物质[4]，柚皮苷的苦味来源于黄烷酮7-O-新橙皮糖苷，而柠檬苦素的苦味来源于柠檬酸α环结构，虽然这些苦味物质具有生物活性如抗氧化性、抗肿瘤、消炎、保护肾脏等效果[5-6]，沙田柚果肉中的苦味物质会影响沙田柚的口感以及加工[7]。苦味在人类中的味觉阈值低，微量即可感受到，而且在口腔中的持续时间相对甜味和咸味要长[8]。目前这2种物质的提取方法有超声辅助提取[9]、索氏提取[10]、亚临界提取法[11]等方法，而其中超声辅助提取方法提取时间短，效率高，操作简便。采用高效液相色谱检测法对柚皮苷素[12]和柠檬苦素[13]这2种苦味物质检测更加快速与准确[14]。

钾肥是香蕉、番茄、西瓜等果蔬产品的肥料之一，因为广东地区柑橘土壤的钾离子含量分布不平衡，导致柑橘缺少钾离子[15-16]。施用钾肥可以增加柑橘的产量与营养，改变其外观品质[17]。氯化钾肥料是传统的钾肥，硫酸钾镁肥料是近年来新兴使用的肥料[18]。硫酸钾镁肥料比氯化钾肥料多了几种矿物质元素，但肥料对应于土壤的酸碱度和植物种类都有要求。

对于沙田柚的生长，研究表明，土壤中的中量和微量元素对黄酮类化合物有正相关的影响[19]。施用不同肥料对沙田柚生长有不同影响[20]，由于梅州沙田柚在2021年施用硫酸钾镁肥，与原来施用氯化钾肥料相比，發现施用硫酸钾镁肥料的沙田柚甜味与苦涩味均增强，笔者通过高效液相色谱测定沙田柚中的柚皮苷和柠檬苦素含量，再测定镁离子、氯离子以及总硫含量，通过相关性分析得到沙田柚苦涩味增加与这2种肥料中水溶性离子之间的关系，旨在为得到品质更优的梅州沙田柚肥料种类提供有效数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 梅州沙田柚（采摘于梅州市果园）;无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;柠檬苦素和柚皮苷标准品（纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司）;乙腈、甲醇（分析纯，赛默飞世尔科技有限公司）;水（超纯净水）;硝酸、高氯酸、氩气、亚铁氰化钾、乙酸锌、硝酸银、冰乙酸、硝酸、丙酮（广东省测试分析研究所）。

1.2 主要仪器与设备

岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）;电感耦合等离子体发射光谱仪（广东省测试分析中心）;电位滴定仪（广东省测试分析中心）;水浴超声机;德国IKA旋转蒸发仪（RV10，武汉集思仪器设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 感官评价与分级。将30个梅州沙田柚分别剥出一定量的果肉，再请20名感官评价人员对其进行随机品尝，根据柚子肉的苦味程度对应感官评价指标的苦味等级，将这30个柚子样品划分成6个等级，根据回甘的感觉再描述回甘的感受。每个样品随机重复3次，每次尝试完样品后都用清水漱口，防止串味。

1.3.2 苦味物质的提取与前处理。

将柚子榨汁，取10 g果肉汁液，加入50 mL 70%的乙醇，40 ℃下超声萃取45 min[21]，提取2次，再将2次得到的混合液在3 000 r/min下离心15 min，取上清液进行旋转蒸发至近干，加入甲醇-水（50∶50）溶液定容至25 mL，将溶液过0.45 μm滤膜，装入1.5 mL棕色瓶。

1.3.3 柚皮苷标准品的制备与色谱条件。

称取柚皮苷标准品粉末1 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成100 mg/L的标准溶液，超声至完全溶解，液相色谱中分别吸取1、5、10、15、20 μL，做标准曲线。色谱柱：C18色谱柱（柱长100 m，内径0.25 mm，膜厚0.2 μm，Phenomenex C18）;流动相∶甲醇∶水（40∶60，V∶V）[14];流速：1 mL/min;柱温：35 ℃;检测波长：285 nm;进样量：20 μL。

1.3.4 柠檬苦素标准品的制备与色谱条件。

称取柠檬苦素标准品粉末1 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成100 mg/L的标准溶液，超声至完全溶解，液相色谱中分别吸取1、5、10、15、20、30 μL，做标准曲线。色谱柱，C18色谱柱（柱长100 m，内径0.25 mm，膜厚0.2 μm、Phenomenex C18）;流动相，乙腈∶水（45∶55，V∶V）[22];流速，1 mL/min;柱温，35 ℃;检测波长，215 nm;进样量，20 μL。

1.3.5 镁离子、氯离子和总硫的测定。

镁离子根据GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》第二法测定[23]，氯离子根据GB 5009.44—2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》第一法测定[24]，总硫含量根据离子色谱法测定。

1.4 数据处理 采用数据处理软件SPSS 25.0版本对2种苦味物质和3种离子进行相关性分析，用*表示相关性水平为0.05，用**表示相关性水平为0.01。

2 结果与分析

2.1 感官评价结果

分别对30个柚子样品进行感官评价，感官评价指标见表 将柚子的苦味程度分为6个级别，分别为0、2、4、6、8、10级。根据6个级别的指标，分别选出一个柚子代表。结果见表2。

2.2 2种苦味物质的洗脱

分别对柚皮苷和柠檬苦素进行洗脱，采用峰保留时间对样品进行定性分析。在上述条件下分别洗脱出来的2种标准品的峰容易识别出来（图1～2），且对于样品洗脱也容易分离，峰能较好地分开（图3～4），说明在这种洗脱条件下可以较好地洗脱出这2种苦味物质。

2.3 回归方程、线性范围、检测限与定量限

精密按梯度增加吸取量，吸取柚皮苷和柠檬苦素标准溶液分别分析。分别以吸取量为横坐标（μg）、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算出回归方程（表3）。结果表示，高效液相色谱可以很好地识别2种苦味物质，柚皮苷的回归方程为Y=359 774x+285 160，r2=0.998  线性范围为0.130～1.980 μg，柠檬苦素的回归方程为Y=589 865x+1115 725，r2=0.999 8，线性范围为0.132～2.980 μg。以2倍噪声为待测样品的吸取量作为检测限的方法[1]，来确定检测限。则柚皮苷的检测限为0.036 3 μg，定量限为0.072 6 μg，柠檬苦素检测限为0.032 0 μg，定量限为0.064 0 μg。

2.4 回收率和精密性

分别吸取低、中、高的3种体积2.5、10.0、12.5 μL的柚皮苷和柠檬苦素标准品（质量分别为0.250 0、1.000 0、1.250 0 μg）加入已知2种物质含量的样品中（柚皮苷：0.468 0 μg，柠檬苦素：0.218 8 μg），进行加标回收

试验，每组添加量进行3次水平分析，计算其平均值，并求出标准偏差（表4）。结果表示，柚皮苷3种加标量的平均回收率分别为87.23%、91.38%、95.77%，总平均回收率为91.46%。柠檬苦素3种加标量的平均回收率分别为89.34%、93.22%、97.19%，总平均回收率为279.75%。柚皮苷的相对标准偏差为3.13%～4.18%，柠檬苦素的相对标准偏差为4.62%～5.70%。

2.5 柚子样品2种苦味物质测定

对样品进行液相色谱分析测定其中的柠檬苦素和柚皮苷，每个样品进行3次平行分析（表5）。结果表示，高效液相色谱可以很好地分开柚皮苷和柠檬苦素，2种物质的峰较好地分离且峰型良好[25]。所有样品中都含有柠檬苦素和柚皮苷，6号样品柠檬苦素含量最高为2.960 8 μg/mg，1号和5号样品其次，分别为1.330 8和1.084 0 μg/mg，其余样品柠檬苦素含量都较低。柚皮苷在1号样品的含量最多，为1.032 4 μg/mg，对比其他样品相差较大，其余5个样品含量较低。由感官评价分析可知 ，6号样品是所有样品中最苦的（苦味等级10级），而1号样品其次（苦味等级8级），但6号样品的柚皮苷含量较低，由此可知，柠檬苦素对柚子的苦味影响较大，柚皮苷对柚子的苦味影响较小。又因为柚皮苷与橙皮苷相似，不仅提供部分苦味还提供回甘的感觉[26]，根据液相色谱柚皮苷含量结果与感官评价的结果相結合得出2～6号样品回甘感觉弱，1号样品的回甘感觉最重。

2.6 柚子的镁离子、氯离子和总硫的测定

分别根据相应的国标测定柚子的镁离子和氯离子，根据CI法测定总硫含量，每个样品分别进行3次平行分析，结果见表6。由表6可知，这批柚子的镁离子含量在55.4～89.2 mg/kg，其中6号样品含量最高，3号样品含量最低。氯离子含量在0.005 0%～0.009 1%，其中4号样品含量最高，1号样品含量最低。总硫含量在123～162 mg/kg，其中6号样品含量最高，3号样品含量最低。

2.7 柚子苦味物质与离子的相关性分析

将柚子的柚皮苷和柠檬苦素2种苦味物质，镁离子、氯离子和总硫含量3种离子进行相关性分析，可以得出影响柚子苦味程度的影响因素，结果见表7。由表7可知，柚皮苷和其余5种指标相关性较低，与总硫含量呈负相关。说明这5种指标对柚皮苷影响程度不大，所以对柚子的苦味影响也不高。柠檬苦素与感官评价、镁离子和氯离子的相关性大，其中柠檬苦素和感官评价的相关性极显著，反映出柠檬苦素和柚子的苦味相关性强。柠檬苦素和镁离子也呈极显著相关性，表明镁离子的含量正相关显著影响柠檬苦素含量。柠檬苦素与氯离子含量相关性显著，但相较于与感官评价和镁离子而言，氯离子的相关性较弱。柠檬苦素含量与总硫含量呈负相关关系。感官评价与镁离子、氯离子的相关性也极显著，表明感官评价与镁离子和氯离子呈显著正相关。相比柠檬苦素，柚皮苷提供苦味能力较弱，可能因为柚皮苷不仅提供苦味感觉，还提供甘味[26]。所以苦味物质提供主要还是柠檬苦素。影响柚子苦味的因素可能还不止这2种苦味物质，还可能与其中的其他因素有关，如诺米林[27]等。

3 结论与讨论

该试验通过对苦味柚子进行柚皮苷和柠檬苦素2种苦味物质的提取，然后进行液相色谱定量试验，再检测其中可能影响苦味的镁离子、氯离子和总硫含量，通过相关性分析确认其之间的关联。结果表明，柚子的2种苦味物质与镁离子和氯离子含量有很高的相关性且呈正相关，而与总硫含量相关性较弱。镁离子和氯离子含量的提高会导致柚子内部柚皮苷和柠檬苦素2种苦味物质增多，从而使得柚子的口感变苦。

通过改变肥料导致柚子果肉变苦的研究较少，主要是因为果树缺少什么离子或者养分而增加哪种肥料，或者是缺少某种元素导致的后果。虽然我国土地缺少钾元素，但施用不同肥料要综合梅州的土壤、柚子果树的树龄和季节等因素，才能得到稳定高质量的果实和减少肥料的施用以及对环境的保护[3，28]。所以，梅州果园采用的硫酸钾镁肥料并不适合用于柚子果树，建议改用其他肥料。

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