桑黄子实体多糖提取工艺优化及其抗氧化活性

袁满，付婷伟，徐晨，陈安徽, ，邵颖,

1.徐州工程学院食品（生物）工程学院（徐州 221111）；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，徐州工程学院（徐州 221111）

桑黄菌是一种珍稀的大型多年生食药用真菌，隶属担子菌亚门、多孔菌科、木层孔菌属，有“森林黄金”的美称[1-2]。桑黄在我国分布广泛，主要寄生在杨树、桑树、柳树等的树干上[3]。桑黄在我国医药领域有2 000余年的应用历史[4]，《药性论》《神农本草经》《本草纲目》等古代本草著作中均有桑黄药用的记载，桑黄可用于治疗腹泻、血淋、崩漏带下、经闭、脾虚泄泻等，具有利五脏、排毒、活血等功效[5-6]。自20世纪70年代起，桑黄抗肿瘤、增强机体免疫、保肝护肝、抗衰老、降血糖、降血脂、抗肺炎、消炎等功效不断得到挖掘，桑黄中的主要活性成分如黄酮、多酚类物质、多糖、三萜等逐渐成为研究热点[7-10]。

桑黄多糖作为桑黄子实体及液体发酵菌丝体和发酵液中的主要化学成分，被认为是桑黄抗肿瘤活性的重要功效物质[11]，又鉴于真菌多糖抗氧化、增强免疫等方面的多重活性，因此值得对桑黄多糖进行深入研究。试验对桑黄子实体中的多糖进行提取工艺优化，并对提取得到的桑黄多糖进行体外抗氧化活性研究，旨在对桑黄子实体资源的合理应用及产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

桑黄子实体（宁波御菌生物技术有限公司）。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖标准品（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；DPPH试剂（美国Sigma公司）；浓硫酸（分析纯，上海华科试剂有限公司）；氯化亚铁（分析纯，广东光华化学厂）；菲咯嗪（Ferrozine，分析纯，上海市源叶生物科技有限公司）；氯仿、正丁醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；浓硫酸、苯酚（分析纯，西陇科学股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

梅特勒AE200型电子天平（上海分析仪器厂）；TUMEN TL-15高速离心机（江苏图门离心机厂）；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；R501旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；LGJ-10真空冷冻干燥机（上海比朗仪器有限公司）；UV2802PC紫外-可见光分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 桑黄的处理及多糖的提取

桑黄子实体于50 ℃烘箱中烘干至恒重后反复研磨备用。桑黄子实体粉采用热水浸提、固液分离、醇沉、离心、复溶、去蛋白、醇沉、离心、冷冻干燥的流程提取桑黄粗多糖。

1.3.2 桑黄多糖含量的测定

1.3.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取50 mg经过高温烘干至无水恒重的葡萄糖于500 mL容量瓶中，配成0.1 g/mL的标准溶液，继而用蒸馏水分别配成0，20，40，60，80，100，120和140 g/mL质量浓度的系列溶液。1 mL标准液分别加入1 mL 6%苯酚溶液，并迅速加入5 mL浓硫酸，静置10 min，摇匀后室温下静置20 min，用蒸馏水替代葡萄糖溶液做空白对照，在490 nm条件下测定其吸光度，以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。标准葡萄糖标准曲线回归方程为y=0.005 5x-0.005 3，R2=0.999 6，线性关系良好。

1.3.2.2 桑黄多糖得率测定

准确称取50 mg桑黄粗多糖，准确定容至500 mL容量瓶。取1 mL桑黄多糖溶液于试管中，加入1 mL的6%苯酚，迅速加入5 mL浓硫酸，静置10 min后摇匀。将试管置于40 ℃恒温水浴锅中水浴15 min后取出于490 nm测定吸光度。每个样品设置3个重复，将测定的吸光度代入葡萄糖标准曲线计算桑黄多糖的质量浓度，并按式（1）求取桑黄多糖的得率。

式中：W为桑黄质量，mg；C为桑黄多糖质量浓度，mg/mL；V为桑黄多糖溶液总体积，mL。

1.3.3 液固比对桑黄多糖得率的测定

准确称取5份5 g桑黄子实体粉，并放入烧杯中，分别按照液固比10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1 mL/g加入蒸馏水并于80 ℃水浴锅中提取2 h，过滤并浓缩后加入95%乙醇使其终浓度达到80%，在4 ℃条件下静置10 h。使用离心机在5 000 r/min条件下离心10 min后收集沉淀，沉淀冷冻干燥后复溶，加入除蛋白试剂（正丁醇∶氯仿=1∶4，V/V），使其最终浓度达到25%，充分振荡1 h左右，在4 000 r/min的条件下离心10 min，收集水层。再次加入95%乙醇使其终浓度达到80%，在4 ℃条件下静置10 h。使用离心机在5 000 r/min条件下离心10 min后收集沉淀，沉淀冷冻干燥后测定桑黄多糖得率。每个样品重复3次。

1.3.4 提取温度对桑黄多糖得率的测定

准确称取5份5 g桑黄子实体粉，并放入烧杯中，按照液固比20∶1 mL/g加入蒸馏水，并分别在60，70，80，90和100 ℃水浴锅中提取2 h，过滤并浓缩后加入95%乙醇使其终浓度达到80%，在4 ℃条件下静置10 h。使用离心机在5 000 r/min条件下离心10 min后收集沉淀，沉淀冷冻干燥后复溶，加入除蛋白试剂（正丁醇∶氯仿=1∶4，V/V），使其终浓度达到25%，充分振荡1 h左右，在4 000 r/min条件下离心10 min，收集水层。再次加入95%乙醇使其终浓度达到80%，在4 ℃条件下静置10 h。使用离心机在5 000 r/min条件下离心10 min后收集沉淀，沉淀冷冻干燥后测定桑黄多糖得率。每个样品重复3次。

1.3.5 提取时间对桑黄多糖得率的测定

准确称取5份5 g桑黄子实体粉，并放入烧杯中，按照液固比20∶1 mL/g加入蒸馏水并在90 ℃水浴锅中分别提取1，2，3和4 h，过滤并浓缩后加入95%乙醇使其终浓度达到80%，在4 ℃条件下静置10 h。使用离心机在5 000 r/min条件下离心10 min后收集沉淀，沉淀冷冻干燥后复溶，加入除蛋白试剂（正丁醇∶氯仿=1∶4，V/V），使其终浓度达到25%，充分振荡1 h左右，在4 000 r/min条件下离心10 min，收集水层。再次加入95%乙醇使其终浓度达到80%，在4 ℃条件下静置10 h。使用离心机在5 000 r/min条件下离心10 min后收集沉淀，沉淀冷冻干燥后测定桑黄多糖得率。每个样品重复3次。

1.3.6 桑黄多糖提取工艺优化

采用响应面法优化桑黄粗多糖提取工艺。根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，以液固比（mL/g）、提取温度（℃）和提取时间（h）为自变量，以桑黄多糖得率（Y）为响应值，设计三因素三水平试验，因素水平表如表1所示。每个样品重复3次。

表1 Box-Behnken试验因素水平表

1.3.7 桑黄多糖抗氧化活性测定

1.3.7.1 桑黄多糖DPPH自由基清除活性检测

参照邵颖等[12]的方法并改进。将桑黄多糖配制成质量浓度分别为0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，4.5，6.0，8.0和10 mg/mL的溶液。分别取2.0 mL各质量浓度的多糖溶液于试管中，加入2 mL 95%乙醇配制的浓度0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均匀，室温避光放置30 min，在517 nm条件下测定吸光度，记为Ai；移取2.0 mL各多糖溶液与2.0 mL 95%乙醇于试管中，混匀后室温避光防置30 min后测定517 nm处的吸光度，记为Aj；移取2.0 mL 95%乙醇和2.0 mL DPPH溶液混匀，测定517 nm下的吸光度，记为Ac；试验以VC做阳性对照。DPPH清除率按照式（2）计算。

1.3.7.2 桑黄多糖铁离子螯合能力测定

铁离子螯合能力的测定参考邵颖等[13]的文献并略有改进。将桑黄粗多糖样品用蒸馏水配制质量浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0和4.5 mg/mL的多糖溶液。移取各浓度多糖溶液2 mL，加入0.1 mL 2 mmol/L氯化亚铁，加入0.2 mL 2 mmol/L菲咯嗪（Ferrozine），混匀后在室温下静置10 min，加入等体积的去离子水并在562 nm下测定其吸光度，记为A1。以去离子水作空白调零。吸光度越低则表明铁离子鳌合能力越强。以去离子水代替样品作为空白对照，吸光度记为A0，以稀释至不同质量浓度的EDTA作为阳性对照。按照式（3）计算桑黄多糖的铁离子螯合能力。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用DPS（V7.05）专业版数据统计分析软件进行数据统计分析。试验数据统计结果均以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 桑黄多糖提取工艺优化

2.1.1 液固比对桑黄多糖得率的影响

按照1.3.3的方法考察液固比对桑黄子实体多糖提取得率的影响。具体试验结果如图1所示。

图1 液固比对桑黄多糖得率的影响

从图1可以看出，桑黄子实体多糖得率随着液固比提高而提高，液固比10∶1（mL/g）时，多糖得率为6.22%，而液固比20∶1（mL/g），多糖得率为8.02%，显著高于液固比10∶1（mL/g）时多糖得率（p＜0.05），但液固比超过20∶1（mL/g）后，多糖得率虽在数值上有一定增加，但未达到显著水平。所以，最优桑黄多糖提取液固比选择20∶1（mL/g）。

2.1.2 提取温度对桑黄多糖得率的影响

提取温度是桑黄子实体多糖提取得率的重要影响因素，不同提取温度条件下桑黄子实体多糖的提取得率如图2所示。

由图2可知，在60~90 ℃温度范围内，桑黄子实体多糖的提取得率随着提取温度升高显著增加（p＜0.05）。温度90 ℃时，多糖得率达到8.22%，在提取温度提高到100 ℃时，多糖得率为8.24%，2个提取温度对多糖得率的影响并不显著（p＞0.05）。因此，从节约能耗的角度出发，选择提取温度90 ℃并进行后续提取工艺优化试验。

图2 提取温度对总桑黄多糖得率的影响

2.1.3 提取时间对桑黄多糖得率的影响

提取时间对桑黄子实体多糖提取得率的影响试验结果如图3所示。

图3 提取时间对桑黄多糖得率的影响

由图3的结果可以看出：提取时间在2 h之内，桑黄多糖得率会随着提取时间延长而增加，提取时间2 h时，桑黄子实体多糖得率达到8.18%，显著高于提取时间1 h时的多糖得率（p＜0.5）；提取时间超过2 h，桑黄多糖得率便未显示出随提取时间延长而增加趋势。因此，最优提取时间选择2 h。

2.1.4 Box-Behnken试验

2.1.4.1 回归模型的建立与检验

为综合分析提取液固比、提取温度和提取时间对桑黄子实体多糖得率的影响，采用响应面法设计三因素三水平试验以优化桑黄子实体多糖的最佳提取工艺。具体的试验方案及结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

对表2的试验数据用多元回归拟合后，得到总桑黄多糖得率（R）与液固比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）的回归方程：R1=-27.954 50+0.651 028A+0.520 80B+3.980 25C-0.003 875AB-0.002AC-0.010 250BC-0.006 06A2-0.002 085B2-0.646 00C2。

由表3方差分析可得，模型的p值小于0.01，可行度较好，说明该模型有意义，所以可以用于设计范围内的预测。回归模型的R2=0.960 4，Radj2=0.909 5，说明桑黄多糖得率的试验值与预测值之间具有良好拟合度。该模型的失拟项p值为0.461 4＞0.05，失拟项差异不显著，说明试验操作可信。由表2的结果以及表3、回归方程可知，方程中A、B、C、A2、C2对多糖得率影响显著，在各个影响因素中，对桑黄多糖得率影响最大的是液固比，其次是提取温度，提取时间影响最小。试验因素对多糖得率不是简单的线性关系，二次项系数对多糖得率也有很大的影响，但是表3分析结果显示交互作用不明显。

表3 回归模型方差分析

2.1.4.2 两因素间的交叉效应分析

为研究2个因素间的交互效应对桑黄多糖得率的影响，可固定其他因素为零水平，绘制响应面图谱，如图4~图6所示。

响应面的坡度越是陡峭，说明总桑黄多糖的得率对该因素的改变越敏感，影响桑黄多糖得率的最主要因素是液固比，提取温度次之。由图4可知，当液固比处于较低水平时，随着温度增加，多糖得率呈现先快速增加，后增加趋势趋于平缓的趋势；液固比处于较高水平，随着温度增加，多糖得率呈现先缓慢增加后有下降的趋势。从图5可以看出，当液固比处于较低水平时，随着提取时间的增加，多糖得率先增加后缓慢下降；当液固比处于较高水平时，随着提取时间增加，多糖得率呈现先增加后缓慢的下降。由图6看出：当提取温度处于较低水平时，随着提取时间增加，多糖得率呈现先增加后有下降的趋势；当提取温度处于较高水平时，随着提取时间增加，多糖得率先增加后下降。

图4 提取温度与液固比的交叉作用对多糖得率的影响

图5 提取时间与液固比的交叉作用对多糖得率的影响

图6 提取时间与提取温度的交叉作用对多糖得率的影响

2.1.4.3 最佳条件优化及验证结果

通过Box-Behnken软件分析，预测得出桑黄子实体多糖提取工艺的最佳工艺的水平编码值：A=0.161、B=0.924、C=0.259，相当于液固比21.61∶1（mL/g）、提取温度99.24 ℃、提取时间2.26 h，在该条件下桑黄多糖提取率的理论值为9.423%。鉴于实际操作，将各个因素设置为液固比21.6∶1（mL/g）、提取温度99℃、提取时间2.3 h，在此修正条件下进行桑黄多糖提取试验，桑黄子实体多糖得率达到9.398%，与理论值相比，误差仅0.025%，验证方程可行性。

2.2 桑黄多糖抗氧化活性分析

2.2.1 桑黄多糖DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除能力是测定多糖体外抗氧化活性常用的方法之一。试验对提取的桑黄子实体多糖进行DPPH自由基清除活性检测，具体的试验结果如图7所示。

图7 桑黄多糖对DPPH自由基清除作用

在测定多糖浓度范围内，可以看出多糖清除DPPH自由基的能力始终低于阳性对照VC。桑黄多糖质量浓度在0.25~2 mg/mL范围内，其DPPH自由基清除活性随着桑黄多糖浓度增加而显著增强，表现出一定剂量-效应关系。多糖浓度2.00 mg/mL时其DPPH清除率为76.31%±0.92%，多糖浓度分别为3.00和4.00 mg/mL时，其自由基清除分别为80.79%±1.16%和80.51±0.28%，多糖DPPH自由基清除率增加缓慢，在浓度达到4.00 mg/mL却呈现下降趋势。

2.2.2 桑黄多糖的铁离子螯合能力

铁离子螯合能力也是一种重要的评价各种真菌代谢产物抗氧化能力的指标。桑黄子实体多糖的铁离子螯合能力检测结果如图8所示。

从图8可以看出：桑黄多糖在供试的质量浓度范围内，其铁离子螯合能力均低于阳性对照VC；在0.5~4.5 mg/mL质量浓度范围内，多糖铁离子螯合能力随着样品质量浓度增大而增大；多糖浓度低于3.5 mg/mL时，桑黄多糖的铁离子螯合能力随多糖质量浓度增加而增强的幅度明显；多糖浓度为3.5 mg/mL时，铁离子螯合率为56.66%±0.93%；随后，多糖的铁离子螯合能力随着多糖浓度增加而增强的趋势趋于平缓。多糖浓度为4.0和4.5 mg/mL时，铁离子螯合率分别为57.23%±1.00%和57.89%±1.04%。

图8 桑黄多糖对铁离子螯合作用

3 结论

桑黄是我国重要的药用真菌，也是国际上公认的抗癌功效最强的真菌之一。桑黄子实体中富含多种生物活性物质，但桑黄多糖是其主要功效成分[14]。桑黄多糖抗氧化、抗肿瘤、抑菌、消炎、降糖降脂等功效被广泛认可并得到关注。桑黄多糖的提取工艺及活性研究为桑黄多糖的商品化应用提供实践参考及理论依据。试验采用热水浸提法对桑黄多糖的提取工艺进行优化并初步验证桑黄多糖的抗氧化活性。试验条件下，桑黄多糖的最优提取工艺为液固比21.61∶1 mL/g、提取温度99.24 ℃、提取时间2.26 h，在此提取条件下桑黄多糖得率达到9.398%。得到的桑黄多糖以DPPH自由基清除活性及铁离子螯合能力作为指标考察其体外抗氧化能力，结果发现桑黄多糖具有明显的DPPH自由清除活性和较强的铁离子螯合能力，桑黄多糖浓度4.0 mg/mL时，其DPPH自由基清除率为80.51%±0.28%，铁离子螯合率为57.23%±1.00%。

桑黄子实体中多糖提取工艺的研究为桑黄资源的深入开发与应用提供参考，桑黄多糖较好的体外抗氧化活性也为桑黄多糖在保健品、饲料添加剂甚至医药等领域的应用提供理论依据。