蛋白酶对茶汤中游离氨基酸含量的影响

程谦伟，林颖凤，杨菊，陈通，孟陆丽，郑燕红

广西科技大学生物与化学工程学院（柳州 545006）

中国的茶叶分为绿、白、黄、青、红和黑茶六大类，其中发酵红茶是目前最受人们欢迎的茶类之一[1]。茶蛋白是茶叶中主要的化学成分之一，其除了对茶叶色、香、味具有重要意义，同时还具有降血脂和抗氧化的营养价值[2-4]。茶叶中的茶蛋白含量占茶叶干重的20%~30%，其中非水溶性蛋白约占茶蛋白总量的95%，主要包括谷蛋白和醇溶蛋白[5-6]。但茶叶冲泡后只有少量的水溶性蛋白进入茶汤，约占总蛋白的2%，而大量的非水溶性蛋白则残留在茶渣里，这部分茶蛋白具有很高的潜在利用价值[7]。

在制备发酵红茶的过程中，在其揉捻工序中添加碱性蛋白酶，通过酶解茶叶中丰富的蛋白质，进而增加茶汤中游离氨基酸的含量，提高茶汤的营养价值，为在制茶过程中添加外源酶来改善茶叶的品质和提高茶汤营养价值提供一定的参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要原料、试剂

茶叶（广西柳州三江县）；碱性蛋白酶（酶活力10万 U/g，南宁庞博生物工程有限公司）；茶氨酸（合肥博美生物科技有限责任公司）；茚三酮（天津市大茂化学试剂厂）；磷酸氢二钠（天津市大茂化学试剂厂）；磷酸二氢钾（西陇科学股份有限公司）；等。

1.2 试验仪器

LRH-250-A生化培养箱（广东泰宏君科学仪器股份有限公司）；MS104S电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TU-1950紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；等。

1.3 试验方法

1.3.1 红茶制作工艺

茶青→凋萎→揉捻（加入碱性蛋白酶液，液茶比质量比为1∶5）→发酵→干燥即得成品

1.3.2 茶汤待测液的制备

茶叶浸泡（料液比1∶90 g/mL，100 ℃水浸泡15 min）→抽滤→取滤液定容至100 mL即为茶汤待测液

1.3.3 茶叶发酵工艺的优化

揉捻的过程中加入一定量的碱性蛋白酶液，分别考察了酶添加量（0.4%~1.4%）、发酵时间（5~9 h）、发酵温度（24~32 ℃）等因素对茶汤中游离氨基酸含量的影响。

1.3.4 茶汤中游离氨基酸含量的测定

采用茚三酮比色法测定茶汤待测液中的氨基酸含量[8]。

2 结果与分析

2.1 酶添加量对茶汤游离氨基酸含量的影响

在揉捻的过程中分别按酶添加量0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%加入酶液，在28 ℃的条件下发酵6 h，研究碱性蛋白酶的酶添加量对茶汤中游离氨基酸含量的影响，其结果见图1。由图1可以看出，随着酶用量的增加，茶汤中的游离氨基酸含量呈上升趋势，表明在此条件下随着酶添加量的增加，茶叶中蛋白质的水解程度提高，进而使茶汤中的游离氨基酸含量有所提高。

图1 酶添加量对茶汤游离氨基酸含量的影响

2.2 发酵时间对茶汤游离氨基酸含量的影响

在酶添加量1.2%、发酵温度28 ℃的条件下，分别发酵5，6，7，8和9 h，考察发酵时间对茶汤中游离氨基酸含量的影响。由图2可以看出，茶叶在发酵初期碱性蛋白酶促进蛋白质水解程度提高，因而随着发酵时间的延长，茶汤中的游离氨基酸含量在发酵初期呈上升趋势，在发酵时间达到6 h后游离氨基酸含量变化趋势不明显并随着发酵时间的延长略有下降，这可能是因为随着发酵时间的进一步延长，茶叶中的部分游离氨基酸会转变为醛等物质，从而使游离氨基酸的含量有所下降[9-11]。

图2 发酵时间对茶汤游离氨基酸含量的影响

2.3 发酵温度对茶汤游离氨基酸含量的影响

在酶添加量1.2%、发酵温度分别为24，26，28，30和32 ℃的条件下发酵6 h，研究发酵温度对茶汤中游离氨基酸含量的影响，其结果如图3所示。发酵温度从24 ℃上升至32 ℃的过程中，茶汤中游离氨基酸的含量是随着发酵温度的升高而上升的，这与碱性蛋白酶的酶活力在此条件下随着温度的升高酶活力增大有关。

图3 发酵温度对茶汤游离氨基酸含量的影响

2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，选取酶添加量、发酵时间和发酵温度作为因素，以茶汤中的游离氨基酸含量为指标，进行正交试验，其因素水平表如表1所示。

表1 正交因素水平表

其正交试验结果如表2所示。

表2 正交试验结果

从表2可以看出，在研究的条件下所取得的优方案为A3B2C3，即碱性蛋白酶添加量1.4%、发酵时间6 h、发酵温度28 ℃。茶汤中游离氨基酸含量的因素影响大小依次是B＞C＞A，即发酵时间、发酵温度和碱性蛋白酶添加量对发酵茶的茶汤中游离氨基酸含量的影响依次减小。

对正交试验结果进行方差分析，所得到的方差分析表如表3所示。查表得F临界值F0.05(2,2)=19，F0.01(2,2)=99。由表3可以看出，发酵时间和发酵温度对发酵茶茶汤中的游离氨基酸含量影响显著，其中又以发酵时间的影响最为明显，而碱性蛋白酶的添加量在研究条件下对茶汤中的游离氨基酸的影响差异不显著。在碱性蛋白酶添加量1.4%、发酵时间6 h、发酵温度28 ℃的条件下制备发酵茶，茶汤中的游离氨基酸含量为43.79 mg/100 mL，而未添加碱性蛋白酶制备的发酵茶茶汤中游离氨基酸含量为36.88 mg/100 mL。

表3 正交试验结果的方差分析

3 结论

在酶添加量1.4%、发酵温度28 ℃、发酵时间6 h的条件下制备发酵茶，其茶汤中的游离氨基酸含量为43.79 mg/100 mL，未添加酶在相同条件下进行发酵所得茶叶制得的茶汤中游离氨基酸含量为36.88 mg/100 mL。由此可见，茶叶在揉捻的过程中添加碱性蛋白酶后，在一定的条件下可以促进茶叶中的蛋白质水解，从而使茶汤中的游离氨基酸含量有所增加，改善茶汤的品质。