响应面试验优化大果山楂汁复合酶法脱涩工艺

程天德，游丽君

1.清远职业技术学院食品药品学院（清远 511510）；2.华南理工大学食品科学与工程学院（广州 510640）

大果山楂是一种有着悠久历史的药食两用水果，与中国传统中药山楂具有相似的成分和功效[1-2]。大果山楂既可鲜食，也可加工成山楂酒、山楂果汁、山楂醋、山楂茶等[3-4]。虽然大果山楂营养价值丰富，但由于其味道酸涩，山楂汁、山楂茶等产品难以被消费者广泛接受，因此需要研究可改善大果山楂涩味的深加工技术。果汁脱涩的方法主要有物理脱涩法、化学脱涩法和生物脱涩法[5]。刘国凌等[6]进行活性炭-超声波联合脱除法对岗稔果汁的脱涩研究，有一定脱涩效果，但存在果汁不稳定，易失去原有色泽和风味等缺陷。张珊珊等[7]采用明胶对山荆子果汁进行脱涩，效果较好，但明胶脱涩法特异性强，存在二次沉淀等问题。朱一方等[8]进行单宁酶对刺梨果汁脱涩的研究，并与明胶脱涩法和羧甲基壳聚糖脱涩法进行比较，显示酶法脱涩效果更好，但在最优条件下的单宁脱除率仅为70.67%，部分单宁由于有果胶的保护而无法被分解，导致脱涩效果难以进一步提升。

大果山楂汁的涩味主要来自于单宁类物质[9]，除可采用单宁酶直接降解单宁而脱涩外，还可采用果胶酶、纤维素酶水解大果山楂汁中的果胶和多糖，使大果山楂汁中的单宁失去果胶等物质的保护而与其他胶体共同沉淀，达到脱涩的目的[10]。试验以大果山楂汁中的单宁含量为考察指标，采用单宁酶、果胶酶和纤维素酶进行酶解，在单因素试验的基础上进行正交试验，确定最佳复合酶配比，应用响应面分析法优化大果山楂汁复合酶法脱涩工艺，得出最优工艺条件，以期为大果山楂汁的脱涩和产品品质的改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大果山楂（广东省连山县某大果山楂种植基地）；单宁标准品（上海金穗生物科技有限公司）；500 U/g单宁酶（南宁东恒华道生物科技有限责任公司）；30 000 U/g果胶酶（南宁庞博生物工程有限公司）；20 000 U/g纤维素酶（山东隆科特酶制剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

JJ-2型组织捣碎机（金坛市晨阳电子仪器厂）；UV-759型分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）；JA3003N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）；PHS-25型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；SHA-CA型数显恒温水浴振荡器（常州金坛友联仪器研究所）；CL4S型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大果山楂汁制备工艺

准确称取100 g新鲜大果山楂，加入500 mL pH 5.0的磷酸缓冲溶液，用高速组织捣碎机打浆，煮沸10 min，冷却至室温后于3 500 r/min离心20 min，取大果山楂汁于4 ℃贮存备用。

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 单宁含量测定

参考GB/T 27985—2011[11]进行测定。分别取2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL 10 μg/mL的单宁标准溶液于5个50 mL容量瓶中，依次加入3.0 mL铁（Ⅲ）溶液，置于85 ℃恒温水浴锅中水浴20 min。将冷却至室温的标准溶液分别依次加入4.0 mL pH 5.0的磷酸缓冲溶液、6.0 mL邻二氮菲、1.0 mL EDTA溶液，用蒸馏水定容至刻度后摇匀，静置10 min，以试剂空白作对照，在510 nm波长下测定吸光度，制作单宁标准曲线，回归方程为Y=0.472 5X+0.082 6，R2=0.996 2。参考上述方法测定大果山楂汁酶解前后单宁含量，计算得出单宁脱除率（%）。

1.3.2.2 单酶水解工艺

分别称取一定质量的单宁酶、果胶酶和纤维素酶加入大果山楂汁中，于45 ℃恒温水浴锅中酶解2 h，酶解结束后于95 ℃热水中灭酶15 min，减压抽滤即得酶解液。

1.3.2.3 确定单酶最佳添加量

分别向大果山楂汁中添加0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 g/100 mL的单宁酶、果胶酶和纤维素酶，按照1.3.2.2的工艺进行酶解，分别测定各酶解液中单宁含量，通过分析单酶添加量对酶解液中单宁脱除率的影响，确定各种酶的合适添加量。

1.3.2.4 确定复合酶比例

根据1.3.2.3的试验结果，按照表1进行正交试验，以复合酶比例为变量，按照1.3.2.2的工艺进行酶解，以大果山楂汁单宁脱除率为指标，确定最佳复合酶比例。

表1 复合酶比例的正交试验因素水平表单位：g/100 mL

1.3.3 单因素试验设计

1.3.3.1 酶解温度对大果山楂汁脱涩效果的影响

采用1.3.2.4所确定的最佳复合酶比例加入酶制剂，分别在30，35，40，45，50和55 ℃条件下按1.3.2.2的工艺进行酶解，研究不同温度对大果山楂汁脱涩效果的影响，确定酶解温度的合适范围。

1.3.3.2 酶解pH对大果山楂汁脱涩效果的影响

采用1.3.2.4所确定的最佳复合酶比例加入酶制剂，分别在pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0的条件下按1.3.2.2的工艺进行酶解，研究不同pH对大果山楂汁脱涩效果的影响，确定酶解pH的合适范围。

1.3.3.3 酶解时间对大果山楂汁脱涩效果的影响

采用1.3.2.4所确定的最佳复合酶比例加入酶制剂，按1.3.2.2的工艺分别酶解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h，研究不同酶解时间对大果山楂汁脱涩效果的影响，确定合适的酶解时间。

1.3.4 Box-Behnken试验设计

根据1.3.3的试验结果，选择酶解温度、酶解pH和酶解时间3个因素及各因素合适的水平，依据Box-Behnken试验设计原理，采用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平响应面优化试验，以大果山楂汁单宁脱除率为响应值，利用响应面分析法对大果山楂汁复合酶法脱涩工艺进行优化。响应面优化试验设计的因素水平见表2。

表2 响应面优化试验因素水平表

1.3.5 数据处理

使用Excel 2010软件对数据进行统计分析并绘制图表，采用正交设计助手Ⅱ进行正交试验设计和显著性差异分析，使用Design Expert 8.0.6进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单酶添加量对大果山楂汁脱涩效果的影响

单宁酶、果胶酶和纤维素酶添加量对大果山楂汁单宁脱除率的影响如图1所示。可以看出，3种酶都能提高大果山楂汁单宁脱除率，但单宁酶的影响比果胶酶、纤维素酶更明显，原因在于果胶酶和纤维素酶主要是分解大果山楂汁中的果胶类物质及多糖，使单宁溶出并与其他物质形成胶体而共同沉淀，单宁酶则是直接分解单宁类物质从而降低大果山楂汁中单宁含量。单宁酶添加量0.7 g/100 mL时，大果山楂汁单宁脱除率达到68.35%，继续增加单宁酶，单宁脱除率反而下降。果胶酶添加量达到0.3 g/100 mL时，大果山楂汁单宁脱除率达到26.72%，继续增加果胶酶，单宁脱除率的变化趋势逐渐平缓。纤维素酶添加量0.5 g/100 mL时，大果山楂汁单宁脱除率达到22.66%，继续增加纤维素酶，单宁脱除率的变化趋势逐渐平缓。

图1 单酶添加量对大果山楂汁单宁脱除率的影响

2.2 复合酶比例正交试验结果

复合酶比例正交试验及方差分析结果见表3和表4。

由表3可知，单宁酶的极差为16.257，果胶酶和纤维素酶的极差分别为2.704和2.137，说明单宁酶添加量对大果山楂汁单宁脱除率的影响最大。从各水平的均值可以看出，正交试验所得的最佳复合酶比例为果胶酶0.4 g/100 mL、单宁酶0.7 g/100 mL、纤维素酶0.6 g/100 mL。按此比例添加复合酶，按1.3.2.2的工艺进行酶解验证试验，大果山楂汁的单宁脱除率为86.23%，高于正交试验所有试验组。由表4可知，单宁酶添加量对大果山楂汁单宁脱除率有显著性影响，果胶酶和纤维素酶添加量对大果山楂汁单宁脱除率影响不显著。

表3 复合酶比例正交试验结果

表4 正交试验方差分析表

2.3 单因素试验结果

2.3.1 酶解温度对大果山楂汁脱涩效果的影响

酶解温度对大果山楂汁单宁脱除率的影响如图2所示。随着温度升高，大果山楂汁单宁脱除率随之提高，酶解温度50 ℃时，复合酶解的效果最好，大果山楂汁单宁脱除率达到最大值85.42%，进一步提高温度，大果山楂汁单宁脱除率开始下降，这很可能是由于过高的温度降低复合酶的酶活力，从而影响单宁、果胶和多糖的分解，因此选择酶解温度50 ℃左右进行响应面优化试验。

图2 酶解温度对大果山楂汁单宁脱除率的影响

2.3.2 酶解pH对大果山楂汁脱涩效果的影响

酶解pH对大果山楂汁单宁脱除率的影响如图3所示。随着pH提高，大果山楂汁单宁脱除率随之上升，pH 5.5时，复合酶解的效果最好，大果山楂汁单宁脱除率达到最大值82.76%，进一步提高pH，大果山楂汁单宁脱除率开始下降，这很可能是由于继续提高pH，超出复合酶的最适pH范围，酶活力降低导致单宁、果胶和多糖的分解受到不利影响，因此选择pH 5.5左右进行响应面优化试验。

图3 pH对大果山楂汁单宁脱除率的影响

2.3.3 酶解时间对大果山楂汁脱涩效果的影响

酶解时间对大果山楂汁单宁脱除率的影响如图4所示。随着酶解时间延长，大果山楂汁单宁脱除率随之上升，酶解至2 h时，大果山楂汁单宁脱除率达到最大值84.06%，继续酶解，大果山楂汁单宁脱除率没有太大变化，这可能是由于随着时间的延长，底物活化能逐渐减小，当到达一定时间后底物活化能降至最低，即使时间再延长也很难进一步酶解底物，因此选择酶解时间2 h左右进行响应面优化试验。

图4 酶解时间对大果山楂汁单宁脱除率的影响

2.4 响应面优化试验结果与分析

2.4.1 响应面优化试验结果与方差分析

大果山楂汁复合酶法脱涩工艺的响应面优化试验结果如表5所示。

表5 响应面优化试验结果

响应面优化试验方差分析结果见表6。模型的p值＜0.05，说明回归性显著，结果可信。失拟项p值＞0.05，说明该模型对大果山楂汁复合酶法脱涩工艺的分析和预测可靠。模型的一次项C（酶解时间）影响显著，其余一次项影响均不显著；二次项中酶解温度影响显著，其余二次项影响不显著；交互项中酶解温度与酶解pH交互作用影响显著，其余交互项影响不显著。

表6 响应面试验方差分析结果

2.4.2 响应面分析

不同因素之间的交互作用对大果山楂汁单宁脱除率影响的响应面及等高线如图5，图6和图7所示。

图6 酶解温度与酶解时间交互作用对大果山楂汁单宁脱除率影响的响应面及等高线

图7 酶解pH与酶解时间交互作用对大果山楂汁单宁脱除率影响的响应面及等高线

从3D响应面图可以看出各因素的交互作用对大果山楂汁单宁脱除率影响的响应值都是先随各因素数值的增加而增加，响应值达到极限后，随着各因素数值增加，响应值出现不同程度下降。从图5中的等高线可以看出，酶解温度与酶解pH之间的交互作用对大果山楂汁单宁脱除率具有显著性影响，其他因素之间交互作用的影响不显著，这与表6中交互项AB（酶解温度与酶解pH）的分析结果一致。

图5 酶解温度与酶解pH交互作用对大果山楂汁单宁脱除率影响的响应面及等高线

2.4.3 验证试验

采用Design Expert 8.0.6软件对回归模型进行预测分析，将大果山楂汁单宁脱除率值设置得尽可能大，得出最佳酶解条件：酶解温度50.4 ℃、酶解pH 4.96、酶解时间2.5 h。单宁脱除率为90.53%。为便于操作，确定酶解条件：酶解温度50 ℃、酶解pH 5.0、酶解时间2.5 h。在此条件下进行3次验证试验，所得单宁脱除率均值为89.92%，与理论值90.53%无显著性差异，表明该预测模型科学可行。

3 结论

单宁又被称为植物多酚，是广泛存在于果蔬中的一种多元酚类化合物。大果山楂中的单宁含量较高，特别是果皮和果核中的单宁含量明显高于其他部位[12]。大果山楂汁在加工过程中，由于果皮和果核很难完全去除，很容易使其中的大量单宁进入果汁中，影响大果山楂汁的风味和品质[13]。大果山楂汁的涩味主要是由于单宁与口腔中的蛋白质结合生产沉淀，形成收敛感和干燥感而造成的[14]。除此之外，单宁中的酚羟基还可能被氧化成深色的邻醌，导致大果山楂汁色泽不稳定；单宁在酸性条件下还可能发生缩合，形成不溶性大分子从而使果汁变得浑浊[15]。因此，研究如何脱除单宁成为大果山楂汁加工过程中的关键控制点。

单宁酶是一类脂肪酶，又称单宁酰基水解酶，可水解缩合单宁、没食子单宁和没食子酯键。美国、日本等在利用单宁酶提高果汁饮料冷溶性方面的研究较深入。Tsai等[16]研究采用纤维素酶、果胶酶、单宁酶处理茶饮料的效果，结果显示采用单宁酶进行处理后，茶饮料的“冷浑”现象得到明显改善。Chandini等[17]采用单宁酶处理茶饮料，可明显降低茶饮料的儿茶素苦味阈值，改善饮料的苦涩味，口感较好。果胶酶是一类降解果胶基质的酶的总称[18-19]，主要作用于植物细胞壁中的果胶，破坏果胶与半纤维素组成的无定型结构，有助于细胞中的有效成分释出。纤维素酶是一类能够水解纤维素中葡萄糖苷键的酶的总称[20-21]，主要作用于植物细胞壁中的纤维素，与果胶酶一起协作破坏细胞壁，提高内容物的溶出率。

大果山楂在成熟过程中，单宁与果胶相互接触并结合，仅使用单宁酶处理大果山楂汁，单宁脱除率始终有限，这在朱一方等[8]的研究中得到验证。试验联用单宁酶、纤维素酶和果胶酶处理大果山楂汁，破坏大果山楂细胞壁，使细胞内单宁类物质充分释出，提高单宁酶作用时的底物浓度，大幅提高单宁脱除率，有效改善大果山楂汁的涩味。结果显示，采用复合酶法处理大果山楂汁的脱涩效果优于单酶处理法，最佳复合酶配比为果胶酶0.4 g/100 mL、单宁酶0.7 g/100 mL、纤维素酶0.6 g/100 mL。采用响应面法优化复合酶法脱涩工艺，脱涩效果进一步提升，所得的最佳酶解条件为酶解温度50 ℃、酶解pH 5.0、酶解时间2.5 h。此条件下大果山楂汁单宁脱除率为89.92%。