高效液相色谱法测定祛斑美白类化妆品中4种具有美白功效的物质

李 莉,李 硕,王海燕,孙 磊

(中国食品药品检定研究院,北京 100050)

熊果苷能够抑制酪氨酸酶[1-3],阻止黑色素形成,是祛斑美白类化妆品中使用频次较高的功效原料[1]。按照结构不同,可将熊果苷分为α-熊果苷和β-熊果苷,两者为差向异构体[4-5]。氢醌和苯酚具有美白作用,但同时还具有皮肤刺激性和致敏性,长期使用会损伤心血管及中枢神经系统,甚至有潜在的致癌风险[2,5],已经被我国《化妆品安全技术规范》列为禁用物质[6]。在一定环境条件下,熊果苷可被分解形成氢醌[7-11],基于安全考虑,欧盟消费者安全科学委员会(SCCS)建议β-熊果苷在面霜中最高添加量为7%(质量分数,以下残留量、添加量均为质量分数),氢醌最高残留量为0.000 1%[10];α-熊果苷在面霜中最高添加量为2%,润肤露中最高添加量为0.5%[11]。目前我国《化妆品安全技术规范》中对熊果苷的种类规格、使用限量、理化检测方法、功效评价方法等均未进行规定,导致无法对该类产品的安全风险进行科学评估。

祛斑美白类化妆品在我国需求量大,消费者和媒体的关注度高,但相关产品质量良莠不齐,管理及使用均不规范。为了更好地对这类产品进行安全性评价,有必要建立化妆品中α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚同时测定的方法,为祛斑美白类化妆品的标准制定和风险评估提供技术支持。

熊果苷的测定方法主要为高效液相色谱法[12-16]和毛细管电泳法[17]。氢醌和苯酚的测定方法主要为高效液相色谱法[16,18]、气相色谱法[19]和气相色谱-质谱法[8,20]等。同时测定化妆品中熊果苷、氢醌和/或苯酚的方法多为高效液相色谱法[21-23],而相关文献中涉及的熊果苷均为β-熊果苷。目前能够分离并测定祛斑美白类化妆品中α-熊果苷和β-熊果苷这两种差向异构体并同时检测氢醌和苯酚的检测方法尚不多见,已有报道的分析方法[16,21]也存在α-熊果苷和β-熊果苷达不到基线分离的问题。鉴于此,本工作选择了对异构体有较强分离能力的ADME色谱柱作为分析柱,建立了同时测定化妆品中α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚含量的高效液相色谱法,并将该方法应用到102批祛斑美白类化妆品的检测工作中,以期为该类化妆品中α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚的风险评估提供进一步的科学指导。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 1260型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器;AL204 型电子天平;SI Vortex Genie 2型涡旋混匀器;KQ 3200DE 型数控超声波清洗器;Advance RO＋Pro VF型超纯水纯化系统。

单标准储备溶液:分别称取α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚对照品各10 mg(精确到0.000 1 g),用甲醇溶解并稀释配制成1 g·L－1的单标准储备溶液。

混合标准溶液:取α-熊果苷标准储备溶液1 mL、β-熊果苷标准储备溶液1 mL、氢醌标准储备溶液0.2 mL和苯酚标准储备溶液0.2 mL,置于同一个10 mL 容量瓶中,用甲醇稀释配制成α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚质量浓度分别为100,100,20.0,20.0 mg·L－1的混合标准溶液。其他所需质量浓度均由此溶液用甲醇逐级稀释制得。

α-熊果苷对照品的纯度为98.0%;β-熊果苷对照品的纯度为99.0%;氢醌对照品的纯度为99.4%;苯酚对照品的纯度为99.9%;甲醇为色谱纯。

试验所用祛斑美白类化妆品样品采自批发市场、商场、超市、网店,产品外包装标称具有祛斑、淡斑、美白、嫩白、透白等功效。

1.2 仪器工作条件

CAPCELL PAK ADME 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温25 ℃;流量1.0 mL·min－1;进样量为10μL。检测波长:α-熊果苷、β-熊果苷、苯酚均为283 nm,氢醌为290 nm。流动相A 为水,B为甲醇;梯度洗脱程序:0～5.0 min时,A 为96%;5.0～15.0 min 时,A 由96% 降 至10%,保 持5.0 min;20.0～20.1 min 时,A 由10%跳转至96%,保持5.0 min。

1.3 试验方法

称取祛斑美白类化妆品1.0 g(精确到0.000 1 g)于10 mL 具塞比色管中,用甲醇定容至10 mL,振荡30 s后密塞,超声提取10 min。冷却至室温后,以8 000 r·min－1转速离心5 min,取上清液过0.45μm 滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

α-熊果苷和β-熊果苷的最大吸收波长为283 nm,氢醌的最大吸收波长为290 nm,苯酚的最大吸收波长为271 nm。综合考虑4种物质的响应强度,试验选择283 nm 作为α-熊果苷、β-熊果苷和苯酚的检测波长,290 nm 作为氢醌的检测波长。

2.2 色谱柱的选择

试验考察了X-Bridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、CAPCELL PAK ADME 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、CAPCELL PAK PFP色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)等4种色谱柱对加标样品(α-熊果苷和β-熊果苷加标量为100 mg·kg－1,氢醌和苯酚的加标量为20 mg·kg－1)中4种目标物的分离效果。结果表明:X-Bridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)和CAPCELL PAK PFP色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)均不能实现α-熊果苷和β-熊果苷的基线分离(分离度小于1.5),而使用CAPCELL PAK ADME 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分析时,4种目标物均能够实现很好的分离,且色谱柱特异性良好,杂质对目标物无干扰。因此,试验选择的色谱柱为CAPCELL PAK ADME色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。

2.3 提取条件的选择

α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚均易溶于甲醇,因此选择甲醇作为提取溶剂。为了充分提取样品中的目标物,试验考察了超声提取时间分别为5,10,15,20,25 min 时对面霜(膏霜剂型)和精华水(水剂乳液剂型)两种化妆品基质中4种目标物的提取效果。结果表明:超声提取10 min时,4种目标物的提取效果较好;继续延长超声提取时间,β-熊果苷含量呈下降趋势,推测原因为长时间超声提取产生的热量造成了熊果苷的分解[16]。因此,试验选择超声提取时间为10 min。

按照试验方法分析α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚4种目标物的混合标准溶液和标称含有熊果苷成分的化妆品样品溶液,所得色谱图见图1。

图1 混合标准溶液和样品溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and sample solution

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按仪器工作条件分析α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚混合标准溶液系列,以目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:α-熊果苷和β-熊果苷的质量浓度均在1.0～50.0 mg·L－1内、氢醌在0.5～10.0 mg·L－1内、苯酚在0.2～10.0 mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系,其他线性参数见表1。

分别以3 倍的信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),以10倍的信噪比计算测定下限(10S/N),α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚的检出限和测定下限见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法分别对面霜(膏霜剂型)和精华水(水剂乳液剂型)空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个加标水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),所得精密度和回收试验结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2可知,回收率为92.0%～112%,RSD 为0.90%～5.8%。

2.6 样品分析

按照试验方法对102批市售祛斑美白类化妆品样品进行检测,2批样品检出禁用组分氢醌,占总样品数量的2%,其检出量分别为52.8,43.0 mg·kg－1;在22批样品中检出α-熊果苷或β-熊果苷,其中β-熊果苷检出量为0.01%～4.0%,均未超过SCCS规定的最高添加量(7%);α-熊果苷检出量为0.01%～4.8%,其中有2批国产面霜中的α-熊果苷检出量超过SCCS规定的最高添加量(2%)。此外,试验结果表明有19批样品存在标签标识与检出物质不符的问题,如标签标识含熊果苷但并未检出(15批),或者标签未标识熊果苷但检出了熊果苷(4批)。化妆品标签标识作为消费者购买化妆品时重要的参考依据,直接影响消费者对于商品的知情权,如果未按照要求标注成分表内容或者标注的内容与实际成分不符,有可能会产生误导或误用的风险。建议有关部门进一步规范熊果苷作为美白成分添加到化妆品产品中的标签标识要求,并加大对化妆品中添加禁用物质的打击力度,切实保障消费者的用妆安全。

本工作建立了同时测定祛斑美白类化妆品中α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚含量的高效液相色谱法,该方法简便快捷、准确度高,适用于大批量样品快速测定,可为熊果苷等美白原料使用限量研究、安全评估等工作提供检测依据和技术支持。