农业执法案件中未知粉末的分析研究

熊 玥，郑胜兰，尹原妍，吴 玲，刘建晖*，陈慧敏

(1.江苏省兽药饲料质量检验所，南京 210036；2.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，上海 200335)

近年来，由于养殖环节滥用兽药或饲料添加剂甚至违规使用禁用物质从而导致的食品安全问题时有报道，引起了人们的广泛关注[1-2]。对于此类违法行为，农业农村部始终保持高压严打态势，不断更新发布相关的检验方法[3-5]。然而不法分子受到利益驱使，在兽药或饲料中滥用其注册配方以外的非法添加物，手段新奇多样，种类频频更换。更有甚者直接将无生产许可证、无质量检验合格证、无产品标签的“三无”产品作为“秘方”销售给养殖户使用。对此，只有摸清产品中违规添加物的种类及其危害，才能有的放矢的制定相关国家标准，以满足监管需求。

目前，对于此类违规添加物的筛查主要基于两种模式。第一种是通过走访、调研、讯问后对样品进行研判，从而得到化合物的准确信息；如果未能获得有效信息，可利用高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-PDA)法、超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)法、气相色谱-质谱(GC-MS)法等收集样品的信息，并将数据与已录入谱库的化合物进行比较，筛出疑似化合物种类。以上均可称为靶向筛查，得到目标化合物后，设计合理的实验方案确证即可[6-7]。对于既无法获取确切信息又不在谱库中的未知物，其筛查鉴定主要依靠非靶向筛查模式，常借助高分辨质谱(HRMS)的全质量数采集功能，提取感兴趣的色谱峰，获得其精确质荷比及天然同位素分布；然后利用软件进行分子式拟合；最后通过高质量二级碎片信息进行结构解析，推测未知物的主要官能团和裂解途径，从而组成未知物的结构，再通过质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振等方法进行多重确证[8-9]。

本研究先后应用靶向及非靶向筛查技术对养殖环节中查获的“三无”产品进行了未知物的分析，通过超高压液相色谱-飞行时间高分辨质谱(UPLC-TOF-HRMS)采集的数据，推导出疑似化合物结构式；并采用HPLC-PDA法与UPLC-TOF-HRMS法对筛查发现的两种化合物进行了双重确证，以期为农业执法提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器 LC-30A 超高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司)- Triple TOF 4600 飞行时间高分辨质谱仪配PeakView及MasterView软件(美国SCIEX公司)； ACQUITY Arc高效液相色谱仪配2998二极管阵列检测器及Empower 3工作站(美国Waters公司)；XS205DU分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 药品与试剂 待测未知粉末为某市公安分局涉农案件查处过程中缴获的“三无”产品(性状：灰黄色粉末)。盐酸克仑特罗对照品购自中国食品药品检定研究院(批号100072-201503；按克仑特罗(C12H18Cl2N2O)计，含量为90.5%)；盐酸克仑特罗杂质B对照品购自EDQM(批号C2248010；含量为100.0%)。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯(美国MERCK公司)；所用水为超纯水。

1.3 溶液的制备

1.3.1 供试品溶液的制备 取未知粉末约0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理10 min，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为HPLC-PDA供试品确证溶液。精密量取HPLC-PDA供试品确证溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇-水(1∶9，V/V)溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为UPLC-TOF-HRMS供试品初筛及确证溶液。

1.3.2 对照品溶液的制备 取盐酸克仑特罗及盐酸克仑特罗杂质B对照品各约10 mg，精密称定，分别置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；用甲醇-水(1∶1，V/V)溶液稀释制成每1 mL含50 μg的溶液，摇匀，作为HPLC-PDA对照品确证溶液。用甲醇-水(1∶9，V/V)溶液将HPLC-PDA对照品确证溶液稀释制成每1 mL含100 ng的溶液，摇匀，作为UPLC-TOF-HRMS对照品确证溶液。

1.4 仪器条件

1.4.1 UPLC-TOF-HRMS法条件 ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0～1.0 min，保持98% A；1.0～8.0 min，98% A～55% A；8.0～10.0 min，55% A～2% A；10.0～12.0 min，保持2% A；12.0～12.1 min，2% A～98% A；12.1～16 min，保持98% A。采用ESI离子源，在正离子模式下采集数据，电喷雾电压为5500 V，离子源温度为500 ℃，雾化气(氮气)压力为344.75 kPa(50 psi)，辅助雾化气(氮气)压力为344.75 kPa(50 psi)，气帘气(氮气)压力为172.37 kPa(25 psi)；一级质谱扫描范围为50～1000 Da，去簇电压为60 V；碰撞能量为10 eV；二级质谱扫描范围为40～1000 Da，去簇电压为60 V，碰撞能量(CE)为35 eV，碰撞电压扩展能量(CES)为15 eV；开启动态背景扣除(DBS)。

1.4.2 HPLC-PDA法条件 XBridge C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；流速：1.0 mL/min；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0～10.0 min，95% A～40% A；10.0～11.0 min，40% A～95% A；11.0～16 min，保持95% A。二极管阵列检测器，采集波长范围190 nm～400 nm，分辨率1.2 nm，记录276 nm波长处的色谱图。

2 结果与分析

2.1 “三无”产品中未知物的发现与初步分析 按1.4.1项条件采集正离子模式下UPLC-TOF-HRMS供试品初筛溶液的色谱图，对总离子流图进行基峰提取(即把一段时间内响应比较高的信号提取出来，简称BPC)，可见保留时间6.50 min(未知物1)及6.69 min(未知物2)处有较强响应(图1)。借助MasterView软件与自建化合物谱库(主要为常见兽药及养殖禁用药物)进行检索，并使用PeakView软件对分子式进行拟合，参考文献报道推导未知物结构。

图1 UPLC-TOF-HRMS供试品初筛溶液正离子模式下的BPC图

2.1.1 未知物2结构式的分析推测 保留时间6.69 min的未知物2，精确质荷比为277.0870(图2)，其母离子裂解产生m/z259.0761、203.0135、168.0443、132.0670、57.0693的二级特征碎片离子(图3)，与谱库中化合物克仑特罗的二级碎片匹配度高达99.2%。其母离子精确质量数与克仑特罗的理论质量数(m/z为277.0869)偏差仅为0.2×10-6，天然同位素匹配度高，二级碎片与文献报道中克仑特罗的裂解碎片一致[10-11](图4)。结合该产品最终将用于养殖环节等信息，推测未知物2为养殖禁用药物“瘦肉精”克仑特罗。

图2 未知物2色谱峰的精确质量数及同位素分布图

图3 未知物2(虚线之上)与谱库中克仑特罗(虚线之下)的二级碎片匹配结果图

图4 文献报道的克仑特罗裂解途径

2.1.2 未知物1结构式的分析推测 保留时间6.50 min的未知物1，精确质荷比为275.0716(图5)，借助PeakView软件中的分子式拟合功能对其分子式进行预测，结合其母离子的同位素丰度比(图5)，元素组成设置为有机物常见的C、H、O、N、S、P、F、Cl、Br，允许误差范围设置为5×10-6，软件计算给出质量数偏差最小结果为C12H16Cl2N2O(m/z为275.0712)，质量相对误差1.3×10-6，同位素匹配(图5、表1)，该分子式相较于克仑特罗分子式少2个H。该峰主要二级碎片m/z200.9978推测分子式为C8H7Cl2N2、m/z166.0291推测分子式为C8H7ClN2(图6)，均比克仑特罗主要二级碎片分子式C8H9Cl2N2、C8H9ClN2少2个H，推测该未知化合物与克仑特罗结构相似，可能为其类似物。排名第二的预测分子式C9H17N2O2FCl2，其不饱和度(RDB)仅为1，二级碎片偏差也较大，故未做分析。

表1 软件推测的未知物1可能的分子式及排名

图6 未知物1的二级碎片图

查阅国内外文献，未发现关于分子式为C12H16Cl2N2O的“瘦肉精”的报道，仅发现在克仑特罗的合成工艺[12]中给出克仑特罗合成中间体为C12H16Cl2N2O(图7)，该结构式与欧洲药典(EP)中克仑特罗杂质B相同。克仑特罗与克仑特罗杂质B的主要结构区别为苯乙醇胺部分，羟基变成了酮基(图8、图9)。参考克仑特罗裂解途径，推导出克仑特罗杂质B可能的裂解途径(图10)，与未知物1的二级碎片基本吻合，由此推测未知物1为克仑特罗杂质B。

图7 文献报道的克仑特罗合成工艺图

图8 克仑特罗结构式

图9 克仑特罗杂质B结构式

图10 克仑特罗杂质B可能的裂解途径

2.2 未知物的确证

2.2.1 HPLC-PDA法确证 取HPLC-PDA供试品确证溶液、HPLC-PDA对照品确证溶液，按1.4.2项条件分别进样。将HPLC-PDA供试品确证溶液色谱图中未知物1及未知物2的色谱峰分别与HPLC-PDA对照品确证溶液中主峰的保留时间及紫外光谱图进行比对。在该试验条件下，HPLC-PDA供试品确证溶液色谱图中未知物1色谱峰与对照品溶液中克仑特罗杂质B的保留时间一致，紫外光谱无明显差异；未知物2色谱峰与对照品溶液中克仑特罗对照品的保留时间一致，紫外光谱无明显差异(图11、图12)。依据农业农村部公告第289号《兽药中非特定非法添加物质检查方法》液相色谱-二极管阵列法[3]进行结果判定，供试品色谱图中如出现与对照品峰保留时间一致的色谱峰(差异不大于±5%)；在一定的波长范围内，两者光谱图无明显差异；最大吸收波长一致(差异不大于±2 nm)，判定该未知粉末中检出克仑特罗杂质B及克仑特罗。

图11 HPLC-PDA供试品确证溶液的色谱图及紫外光谱图

图12 对照品溶液中克仑特罗杂质B和克仑特罗的色谱图及紫外光谱图

2.2.2 UPLC-TOF-HRMS法确证 在相同条件下，采集克仑特罗杂质B对照品、克仑特罗对照品的二级谱图并载入软件谱库中。使用MasterView软件进行靶向分析：未知物1与克仑特罗杂质B对照品保留时间一致，母离子精确质量数的实测值与理论计算值偏差为0.8×10-6，二级质谱图匹配，见图13；未知物2与克仑特罗对照品保留时间一致，母离子精确质量数的实测值与理论计算值偏差为0.2×10-6，二级质谱图匹配，见图3。参照农业农村部公告第289号《兽药中非特定非法添加物质检查方法》液相色谱-高分辨质谱法[3]进行结果判定，供试品色谱图中如出现与对照品峰保留时间一致的色谱峰(保留时间相对偏差不大于2.5%)；供试品与对照品分子离子峰的质量数偏差不大于5×10-6，且二级质谱图与对照品的二级质谱图一致，判定该未知粉末中检出克仑特罗杂质B及克仑特罗。

图13 未知物1(虚线之上)与谱库中克仑特罗杂质B(虚线之下)的匹配结果图

3 讨论与结论

3.1 样品前处理及仪器方法的选择 对于未知样品来说，前处理方法是否合适直接关系到化合物的检出率。HRMS借助超高的分辨率可以区分复杂背景中的杂质及共流出物，降低了对样品前处理的要求[13]。本样品加入甲醇超声后即可全部溶解，为防止出现溶剂效应，本实验采用了不同比例的甲醇-水溶液作为后续稀释液。为使不同极性的化合物均有可能分离流出，未知物筛查流动相一般采用有机相由低到高的梯度洗脱。HRMS一般不需要使用对照品来优化仪器参数[13]，SCIEX QTOF系列常采用35±15 eV或者40±20 eV作为未知物筛查时二级质谱采集的CE及CES，该条件下采集的二级裂解碎片基本可以满足一般化合物的分析需求。

3.2 克仑特罗及克仑特罗杂质B添加原因分析 “瘦肉精”是一类可用来促进动物体肌肉生长、脂肪代谢，增加瘦肉比例的药物的俗称[14]，当消费者食用含有“瘦肉精”残留的动物产品时，会对其心血管和中枢神经系统产生不利影响，严重的可引发中毒[15]。我国在2002年就已严禁“瘦肉精”作为兽药和饲料添加剂应用于食品动物的养殖环节[16-17]。但是在利益面前，违法生产销售使用“瘦肉精”的行为仍然屡禁不止。经HPLC法定量分析，该“三无”产品中约含克仑特罗16 g/kg；约含克仑特罗杂质B 455 g/kg。在养殖环节中检出克仑特罗杂质B属于首次报道，其与“瘦肉精”克仑特罗结构相似，目前未查询到有关克仑特罗杂质B药理及毒理方面的文献报道，使用后可能出现不确定的风险，需要引起有关部门的重视。本案结案后，警方反馈，在检测结果面前，“三无”产品生产商交代，因克仑特罗合成的收率太低，故添加大量克仑特罗合成中间体(即克仑特罗杂质B)进行销售以降低成本，由此也佐证了研究结果。

3.3 结论与展望 本文介绍了一种使用UPLC-TOF-HRMS对执法送检样品进行未知化合物筛查确证的分析研究方法，为案件的侦破提供了强有力的技术支持。HRMS采取的是高分辨率的全扫描数据采集模式，具有扫描速率快、质量范围宽等特点，生成的文件具有可回顾性，便于对历史数据进行重新分析。运用高精确分子质量、同位素丰度信息结合软件的强大计算功能，可进行谱库检索、分子式预测及结构解析。因此，应用HRMS技术进行定性筛查己经成为了一种趋势[18-19]。目前我国瘦肉精监管主要集中在以克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等[14]为代表的传统“瘦肉精”，不法商贩为了逃避监管和处罚，近几年衍生出了苯乙醇胺A、赛庚啶等许多新型“瘦肉精”药物[20]，隐蔽性更高，安全隐患更大，给“瘦肉精”的监管带来了极大的挑战。因此提高“瘦肉精”、尤其是新型“瘦肉精”及其他用于养殖环节中的违规添加物的检测技术，刻不容缓。