MiR-125a-5p和信号传导与转录激活因子3在胃癌中的表达及其生物学功能

汤小龙, 陈旭峰, 郑 杨, 杨胜兰

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院 消化内科, 江苏 无锡, 214000)

胃癌(GC)是常见的癌症，也是导致死亡的常见原因[1]。目前，胃癌治疗的主要方法是手术结合化疗、放疗等综合疗法[2]。胃癌的发生是一个多因素共同参与的过程，包括环境因素、遗传变化以及其他导致细胞逐渐转化为癌症的危险因素[3], 即使进行根治性切除或GC辅助治疗后，仍有许多晚期患者会复发。微小核糖核酸(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的小型非编码RNA，在疾病进展中发挥重要的调控作用[4]。在有关GC的研究中，发现了部分miRNA与细胞生长、迁移和侵袭密切相关。目前研究[5]显示miR-125a-5p是miR-125家族的一员，在乳腺癌和其他恶性肿瘤中显著低表达，而miR-125的特征性改变表达与各种疾病进展密切相关。信号传导与转录激活因子3(STAT3)是一种可以被不同的细胞因子受体激活的相关基因，广泛参与到人类的生物学进程中[6], STAT3与大多数肿瘤的关系较为密切，其功能也越来越受到人们的重视。本研究假设miR-125a-5p、STAT3是调控胃癌进程的关键调节因子，通过生物信息学及分子生物学手段验证miR-125a-5p、STAT3在胃癌中的表达及其生物学功能，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 生物信息分析

基因表达综合(GEO)数据库用于获取GC和健康对照的miRNA表达数据。GSE93415共40例样本，每对包括原发肿瘤和相应的健康胃黏膜。GSE63121共30例样本(15对胃癌与正常组织)。GSE2379样本共80份，其中包括来自新加坡国家癌症中心和新加坡健康组织库的40份癌组织和40份非癌组织。R软件用于分析miRNA的不同表达。使用StarBase (http: //starbase.sysu.edu.cn/panMirSurvivalExp.php)预测相关作用靶点并计算总生存期。

1.2 临床标本

从2018年1月—2020年1月本院30例胃癌患者中分离出胃癌组织。所有参与者均知情同意。胃癌的诊断经组织病理学证实，术前未进行局部或全身治疗。手术中获取组织样本，立即用液氮冷冻并储存在-80 ℃环境中直至实验。本研究方案获得本院伦理委员会的批准。患者临床病理特征见表1。

表1 30例胃癌患者临床病理特征及其与miR-125a-5p的关系

1.3 细胞培养及处理

胃癌细胞系SGC-7901和BGC823在含有10%胎牛血清的RPMI-1640(Hyclone, 美国)中培养，人胃上皮细胞株GES-1在含10%胎牛血清的DMEM中培养(Hyclone, 美国)并作为健康对照。所有细胞系均从北纳生物获取，并在37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.4 细胞转染

SGC-7901和BGC823细胞系在6孔板中以每孔1×106个细胞接种至融合度为80%～90%, 然后用miR-125a-5p模拟物、miR-125a-5p抑制剂、si-STAT3、pcDNA-STAT3处理。所有质粒均购自GenePharma(中国上海)。按照制造商的方案，使用 Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies，美国)进行细胞转染。

1.5 研究方法

1.5.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR): 根据试剂盒操作规程(Invitrogen, 美国)，使用TRIzol试剂从样品中提取总RNA, 然后使用NanoDrop 2000进行定量。使用SYBR Green qPCR SuperMix Kit (Thermo Fisher, 美国)，按照制造商的说明分析1 μg总RNA。所有样品均使用参考基因GAPDH或U6进行3次重复测试。PCR产物检测是在每个循环后使用SYBR®qPCR Mix(Toyobo, 日本)测量。采用2-△△Ct方法对基因表达水平进行相对定量分析。

1.5.2 蛋白质印迹(Western blot): 根据制造商的方案，通过RAPI裂解缓冲液(Beyotime, 中国)提取蛋白质，然后使用BCA对蛋白质测定并定量。30 μg变性样品通过8%～15%不连续十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。脱脂牛奶封闭1 h, 然后与一抗rabbit-anti-STAT3(ab138222, 1∶1 000), 兔抗 GAPDH(ab8245, 1∶10 000)分别4℃共孵育过夜，试剂均购自Abcam。采用 TBST 洗涤3次后，将膜与从 Abcam 购买的山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(ab7090, 1∶2 000)共孵育1 h。最后，使用ECL Plus(Life Technologies, 美国)指示蛋白质印迹并通过Image J进行分析。

1.5.3 双荧光素酶报告基因检测: 使用TargetScan 6.0预测STAT3 3′UTR中的miR-125a-5p结合位点。STAT3 3′UTR的野生型载体(pmiR-RB-REPORT-h-STAT3 WT)和突变型载体(MUT)由RiBoBio(广州，中国)构建。将细胞一式三份接种在24孔板(每孔1×105个细胞)中。24 h后，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen, 美国)共转染5 nmol/L miR-125a-5p模拟物或对照模拟物和400 ng pmiR-RBREPORT-h-STAT3载体。在转染后36 h, 通过Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega, 美国)测量荧光素酶活性。

1.5.4 细胞活力测定: Cell Counting Kit-8(CCK-8, 上海，中国)用于细胞生长测定。将重悬的SGC-7901和BGC823细胞分别以每孔1×103个细胞接种至96孔培养板中，每孔100 μL细胞悬液。细胞在 37 ℃、5%体积比(v/v)的CO2培养箱中培养。24 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL进行检测, 37 ℃孵育4 h。采用微孔板光度计在 450 nm 处测量吸光度。

1.5.5 克隆形成试验: 1×103个细胞/孔的SGC-7901和BGC823分别接种在含有10% FBS的RPMI-1640培养基的6孔板中，然后将细胞在37 ℃、5% CO2条件下孵育2周。采用PBS漂洗细胞并用4%多聚甲醛固定15 min, 再次洗涤，用GIMSA染色剂染色10～30 min, 用无菌去离子水洗涤并在空气中干燥。在显微镜下计数单个克隆。实验一式三份进行测试。

1.5.6 划痕实验: 将细胞接种在12孔板中，并在完全培养基中生长至约90%, 然后使用200 μL移液器吸头制作划痕。磷酸盐缓冲盐水用于去除分离的细胞。在无血清培养基中24 h后，使用显微镜评估细胞迁移情况。

1.5.7 细胞侵袭检测: 使用涂有Matrigel的transwell室。将5×105个细胞接种在无血清培养基的上室中，底室用含有10% FBS的培养基覆盖。培养24 h后，侵入底部的细胞用PBS洗涤, 4%多聚甲醛固定, 0.1%结晶紫染色。在显微镜下，对侵入的细胞拍照并计数。

1.6 动物实验

雄性C57BL/6小鼠(7周龄)购自辽宁长生生物公司。每只小鼠皮下注射2×107个稳定转染NC质粒miR-125a-5p-agomir的SGC-7901/BGC823细胞。在注射后4周，收获小鼠并进行检查。肿瘤体积=(长轴长×短轴长×2)×0.5。

1.7 统计学分析

采用GraphPad Prism软件进行统计分析，所有定量数据以平均值±标准偏差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MiR-125a-5p在GC组织和细胞系中的表达

本研究qRT-PCR结果显示, miR-125a-5p在所有30对GC组织中下调(图1A), 差异有统计学意义(P<0.01)。本研究还分析了GEO数据库中的GC样品(GSE93415、GSE63121、GSE23739)获得的3个数据集中的miR-125a-5表达，结果显示，与正常组织相比, miR-125a-5p在肿瘤样品中下调(图1B)。为了进一步评估miR-125a-5p的表达是否影响胃癌患者的生存期，作者使用了Starbase数据库进行生存分析。结果显示，与miR-125a-5p表达较低的患者相比, miR-125a-5p表达增加的患者无复发生存率降低(图1C), 差异有统计学意义(Log-rankP=0.021)。GC细胞系中的qRT-PCR结果显示, miR-125a-5p的表达在所有GC细胞系中均下调(图1D), 差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 MiR-125a-5p表达对GC细胞增殖的影响

为了分析miR-125a-5p对GC细胞生存力的影响，作者合成了miR-125a-5p模拟物，并对有或没有经miR-125a-5p模拟物转染的GC细胞进行了CCK-8分析和克隆形成分析。本研究qRT-PCR结果证实，转染后胃癌细胞中miR-125a-5p表达上调(图2A), 差异有统计学意义(P<0.01)。CCK-8显示细胞生长被miR-125a-5p抑制(图2B), 差异有统计学意义(P<0.05)。类似地, miR-125a-5p能够减少胃癌细胞克隆形成的数量(图2C)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 验证STAT3为miR-125a-5p的靶基因

为了测试预测的带有STAT3 3′-UTR区域的miR-125a-5p结合位点是否受miR-125a-5p 的调控，作者将它们的野生型(WT)和突变的3'-UTR区域克隆到pGL3下游来自荧光素酶报告基因(图3A), 差异有统计学意义(P<0.01)。同时, STAT3表达也被确定在GC样品中发生上调(图3B、C), 差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 MiR-125a-5p及STAT3调控对GC细胞增殖的影响

为了验证miR-125a-5p通过靶向STAT3对胃癌细胞的影响，作者首先探讨miR-125a-5p对SGC-823细胞中STAT3表达的影响。当用miR-125a-5p模拟物转染细胞时, STAT3的蛋白质和mRNA表达均下调，而当用STAT3 cDNA转染时，下调被逆转(图4A、B), 差异有统计学意义(P<0.01)。作者进一步确定miR-125a-5p是否通过靶向STAT3影响SGC-823细胞进展，结果表明，转染si-STAT3或miR-125a-5p模拟物转染SGC-823细胞的活力明显受到抑制，而转染STAT3的细胞活力增强; 采用miR-125a-5p模拟物和STAT3共转染的细胞则表现出细胞活力的调节作用被逆转(图4C)。细胞凋亡试验表明, miR-125a-5p过表达或STAT3下调的细胞凋亡率高达25%左右，而STAT3过表达的细胞凋亡率降低(图4D), 差异有统计学意义(P<0.05)。

进一步划痕试验和Transwell侵袭实验结果表明, STAT3组细胞具有更好的迁移和侵袭能力，而miR-125a-5p和si-STAT3组细胞的迁移和侵袭能力受到明显抑制, STAT3的共转染消除了miR-125a-5p的抑制作用(图4E、F), 差异有统计学意义(P<0.05)。此外，作者还对SGC-7901细胞进行了相同的实验，结果显示STAT3可增强SGC-7901细胞活力、迁移和侵袭，同时抑制细胞凋亡，这些作用被miR-125a-5p的过表达所逆转，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

2.5 MiR-125a-5p 的体内功能情况检测

体内实验结果显示，与miR-NC组比较, miR-125a-5p-agomir组肿瘤质量、体积降低(图6A), 差异有统计学意义(P<0.01)。此外，作者还进行了qRT-PCR以确认体内miR-125a-5p的相对表达水平，结果显示, miR-125a-5p-agomir在动物组织中增加(图6B), 差异有统计学意义(P<0.01)。此外，作者发现所检查的小鼠GC样品表现出比匹配的相邻非癌性胃组织更低的STAT3蛋白表达(图6C)。最后，形态学检测同样验证了miR-125a-5p能够抑制肿瘤增殖并促进肿瘤细胞凋亡(图6D)。MiR-125a-5p通过在体内靶向STAT3在胃癌中发挥调控作用。

3 讨 论

研究[7]报道了miRNA在GC发展中起着重要作用。本研究发现 miR-125a-5p在GC组织、正常黏膜、GEO 数据库和细胞系均显著降低，表明miR-125a-5p可作为预测GC预后的潜在生物标志物。本研究还证实了miR-125a-5p在体外和体内对GC的抑制作用，包括抑制细胞增殖、迁移和侵袭。进一步研究发现, STAT3作为miR-125a-5p的靶基因发挥作用，并在双荧光素酶报告基因检测中验证了miR-125a-5p与STAT3的调控关系。此外，在GC细胞中, STAT3的mRNA和蛋白质水平均与miR-125a-5p呈负相关。本研究还发现，敲低 STAT3能够逆转miR-125a-5p对BGC823、SGC-7901细胞增殖的影响。因此，本研究结果表明miR-125a-5p可以通过在体外和体内抑制STAT3来调节GC细胞的进程。

在正常生理条件下, STAT3既是转录激活因子，又是致癌基因[8]。然而，研究[9]表明STAT3在癌症中被显著激活，在肿瘤的发生和进展中起着至关重要的作用。除了在癌细胞增殖、侵袭和迁移中的传统作用外，STAT3作为转录因子还通过改变癌细胞中其他基因的表达来促进癌症的发展[10]。目前研究[11]证实包括GC在内的各种类型的肿瘤中观察到 STAT3 的过度表达，这一点在本研究中也被证实。本研究验证了miR-125a-5p对STAT3的靶向调控作用，这为未来的靶向治疗提供了可行的数据支撑。本研究仅使用BGC823和SGC-7901这两种细胞系，并且更深入的分子机制也尚不明确, miR-125a-5p能否在临床实践中发挥同样的肿瘤抑制作用，还需要更多的临床研究来证实。

综上所述，本研究结果表明miR-125a-5p能够通过抑制STAT3的表达发挥肿瘤抑制作用，这将为临床靶向治疗及早期生物标志物的选择提供可靠的理论依据。