麻黄细辛附子汤对变应性鼻炎小鼠线粒体氧化应激损伤AMPK-PGC-1α通路的影响

刘男男 于雪 张艺 马煜洋 潘佳创 孙彤彤 吴璐蔚 倪钰莹 范淑月 刘敏

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一种发生在鼻粘膜上主要由免疫球蛋白 E(immunoglobulin E, IgE)介导的Ⅰ型变态性反应，临床上以鼻痒、流清涕、打喷嚏等为主要表现，常迁延不愈、反复发作[1]。研究表明经卵蛋白(ovalbumin,OVA)致敏的小鼠肺部存在着广泛的氧化应激损伤[2]，线粒体损伤是导致活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增加、氧自由基大量产生、诱发或加重氧化应激损伤与炎症之间级联反应的重要原因[3]。因此研究对线粒体氧化应激损伤具有保护作用的药物对于减缓AR发病的病理进程，发挥治疗AR作用具有重要的指导意义。本实验从线粒体氧化应激的角度入手，探讨麻黄细辛附子汤治疗AR的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6J雄性小鼠21只，体质量(18±2)克，购买于北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0002。小鼠饲养于北京中医药大学东方医院SPF级动物房[许可证号：SYXK(京)2019-0013]，温度(24±2)℃，湿度50%±10%，12/12小时光照周期，实验室定时通风，通风状态良好，实验期间动物自由进食和进水。本实验通过北京中医药大学东方医院伦理委员会批准(伦理审批号：201921)。

1.2 实验药物

麻黄细辛附子汤常规用药量[4]麻黄6 g、附子9 g、细辛3 g，均购买于北京仟草中药饮片公司。常规法煎煮，浓缩至药物浓度0.7 g/mL,按照成人与小鼠体表面积换算法[5]，换算成小鼠剂量7.8 g/kg体质量进行中药灌胃。

1.3 实验试剂与仪器

腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)α2抗体(英国abcam公司，批号：ab3760)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMPK，p-AMPK)Thrl72位点 (40H9)兔单克隆抗体(美国Cell signaling公司，批号：2535T)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α, PGC-1α)抗体(英国abcam公司，批号：ab191838)。PageRulerTMPrestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa(美国Thermo公司，批号：26617)。SDS-PAGE电泳系统(美国BIO-Rad)，4℃低温高速离心机(美国Thermo)。酶标仪(ZS-3板式酶标仪)。凝胶成像仪(美国BIO-Rad)。

1.4 造模与分组

SPF级C57BL/6J小鼠适应性饲养7天之后按随机数字表法随机抽取5只作为空白组，其余16只按照如下方法进行AR模型制备：用OVA 150 μg+佐剂、PBS各50 μL对模型组小鼠进行腹腔注射，隔日注射1次，共7次。基础致敏完成后第2天，用500 μg OVA+PBS 20 μL进行滴鼻激发，每次每只单侧鼻腔各10 μL，连续7天。自激发阶段开始，对小鼠的行为学进行观察和评分，每次观察20分钟，评分叠加达5分及以上者为造模成功，评分指标包括擦鼻、流涕和喷嚏，评分原则如表1所示。

表1 AR模型小鼠行为学评分表[8-9]

在最后一次OVA滴鼻激发24小时后对小鼠行眶后静脉丛取血0.3 mL，常温静置2小时血液分层之后离心取上清(4℃，12000 r/min，5分钟)，用酶联免疫吸附试剂盒检测血清中IgE抗体。实验过程中因操作不当造成个别小鼠死亡，最后总得AR模型小鼠12只，将造模成功的12只小鼠随机分为模型组和麻黄细辛附子汤治疗组，每组6只。

1.5 给药方法

造模成功7天后，麻黄细辛附子汤治疗组每只小鼠灌胃给药0.2 mL，每天一次，连续14天; 模型组每只小鼠灌胃等量的生理盐水，空白组不做任何处理。

1.6 检测指标

1.6.1 肺组织病理学变化 用脱颈椎法处死小鼠，在冰盒上取出肺脏，用PBS溶液冲洗掉组织表面的血迹之后放在4%的多聚甲醛中固定，石蜡包埋后进行苏木精和伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，显微镜下观察肺组织的病理学变化。

1.6.2 透射电镜观察肺组织中线粒体的超微结构 前期操作同上，之后取肺置于2%PFA+2.5%戊二醛固定液中，用消毒刀片将固定液中的肺组织切成1 mm3小块并放到盛有2%PFA+2.5%戊二醛的注射器中，排空肺中气体后将肺组织放到冰上盛有1 mL 2%PFA+2.5%戊二醛的1.5 mL的EP管架中，之后依次经过如下步骤进行操作：(室温)0.1 MPB冲洗；(冰盒)特制锇酸(1%锇酸+1.5%亚铁氰化钾)后固定；(室温)超纯水清洗样品；1%醋酸双氧铀染色；(室温)超纯水清洗样品；(冰盒)梯度乙醇脱水；(冰盒)环氧丙烷置换2次；(室温)渗透；60℃烘箱包埋聚合，最后置于电镜下观察。

1.6.3 比色法检测脾组织SOD活性、MDA含量 在冰盒上取出小鼠脾脏，用生理盐水洗掉组织表面的血迹，制成组织匀浆，严格按照试剂盒操作检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。

1.6.4 比色法检测脾组织ATP含量 前期处理同1.6.3，组织匀浆提取脾组织线粒体之后严格按照试剂盒操作。

1.6.5 比色法检测脾组织呼吸链复合物Ⅰ、Ⅸ活性 操作同1.6.4。

1.6.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot，WB)检测AMPKα2、p-AMPK(Thrl72)、PGC-1α的表达 取适量脾组织加5倍体积的RIPA裂解液在冰上研磨，研磨充分后静置30分钟，之后4℃，12 000 r/min，15分钟离心取上清放在-20℃的冰箱里备用。用BCA试剂盒进行蛋白定量。取样品蛋白和5×蛋白上样缓冲液混合，沸水煮5～15分钟后立即冰浴进行上样，上样后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳，65 V转膜2小时，5%脱脂牛奶室温摇床封闭1小时，1×TBST洗膜3次，每次10分钟。一抗孵育4℃过夜，1×TBST洗3次，每次10分钟。二抗室温摇床孵育1小时，1×TBST洗膜3次，每次10分钟。配制ECL显色液，孵育后显影，曝光，保存条带，用Image J进行软件灰度值分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组AR小鼠血清IgE含量比较

与空白组比较，模型组小鼠血清中IgE抗体含量增加(P<0.01)。经麻黄细辛附子汤治疗后，IgE抗体含量明显降低(P<0.01)，但仍高于空白组(P<0.01)。见表2。

表2 各组AR小鼠血清IgE含量比较

2.2 各组AR小鼠肺组织病理学变化

空白组肺组织结构完整，形态正常，肺泡及支气管结构清晰可见，肺泡隔、支气管腔无增厚，气道周围组织无充血水肿，黏膜及黏膜下层组织内未出现炎症细胞浸润的情况，模型组支气管壁及肺泡隔增厚、支气管腔狭窄、气道周围组织充血水肿、杯状细胞增多、黏膜及黏膜下层组织内出现大量炎症细胞浸润等情况，麻黄细辛附子汤治疗组较模型组各病理表现均有明显的改善。见图1。

2.3 各组AR小鼠肺组织线粒体超微结构变化

空白组线粒体呈哑铃状、短杆状，未发生水肿、变性，基质电子密度中等且均匀，线粒体膜完整，线粒体嵴呈板层状，排列整齐，与线粒体长轴平行或者垂直。模型组线粒体水肿、变性、呈空泡状改变，基质电子密度降低，线粒体膜溶解，线粒体嵴减少、排列紊乱，大部分线粒体嵴断裂。经麻黄细辛附子汤治疗之后大部分线粒体水肿和空泡状改变消失，基质电子密度影均匀，线粒体大部分呈短杆状、哑铃状，双层膜恢复，线粒体嵴增多、排列整齐，与线粒体长轴垂直或平行。见图2。

2.4 各组AR小鼠脾组织SOD活性、MDA含量比较

与空白组比较，模型组脾组织SOD活性降低(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)。经过麻黄细辛附子汤治疗之后，SOD活性升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组AR小鼠脾组织SOD活性、MDA含量比较

2.5 各组AR小鼠脾组织ATP含量比较

与空白组比较，模型组ATP含量减少(P<0.01)，经麻黄细辛附子汤治疗之后ATP含量增加(P<0.05)。见表4。

表4 各组AR小鼠脾组织ATP含量比较

注：A 空白对照组；B 模型组；C 麻黄细辛附子汤治疗组;标尺=100 μm

注：A 空白对照组；B 模型组；C 麻黄细辛附子汤治疗组；标尺=1 μm

2.6 各组AR小鼠脾组织呼吸链复合物Ⅰ、Ⅸ活性比较

与空白组比较，模型组呼吸链复合物Ⅰ活性降低(P<0.01)，呼吸链复合物Ⅸ活性降低(P<0.01)。经过麻黄细辛附子汤治疗之后，呼吸链复合物Ⅰ活性升高，但与模型组比较，差异不具有统计学意义(P>0.05)；呼吸链复合物Ⅸ活性升高(P<0.05)，见表5。

表5 各组AR小鼠脾组织中呼吸链复合物Ⅰ、Ⅸ活性比较

2.7 各组AR小鼠脾组织AMPKα2、p-AMPK(Thrl72)、PGC-1α蛋白的相对表达量比较

与空白组比较，模型组AMPKα2蛋白表达减少(P<0.05)，p-AMPK(Thrl72)蛋白表达减少(P<0.05)，PGC-1α蛋白表达减少(P<0.01)。经麻黄细辛附子汤治疗之后，AMPKα2蛋白表达增加(P<0.05)，p-AMPK(Thrl72)蛋白表达增加(P<0.05)，PGC-1α蛋白表达增加(P>0.05)。见表6。

表6 各组AR小鼠脾组织AMPKα2、p-AMPK(Thrl72)、PGC-1α蛋白的相对表达量比较

3 讨论

氧化应激损伤是指机体氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，与炎症反应之间具有协同作用，可通过正反馈机制加速AR病理进程[4]。线粒体在平衡ROS生成、细胞凋亡及通过氧化磷酸化生成ATP的过程中具有重要的作用。研究表明经OVA诱导的小鼠肺部存在广泛的氧化应激损伤。在炎症环境下，氧化应激反应产生大量的氧自由基导致线粒体损伤，外膜破裂，膜转运孔道开放造成线粒体基质内高渗透压,使线粒体内外梯度消失，呼吸链脱偶联，能量产生异常[7]并释放出包括细胞色素C在内的各种活性蛋白和ROS[8]。释放的线粒体成分充当细胞外“损伤相关模式分子”，通过与病原相关分子模式的受体关联而触发免疫级联反应。加重炎症和氧化应激反应[4]。

AMPK是PGC-1α的上游通路蛋白，是重要的能量调节因子。Thr172是AMPK活化的关键磷酸化位点，PGC-1α在调节线粒体的生成和功能方面具有重要作用。当机体内AMP/ATP比值增加时，AMPK活化，活化的AMPK可以直接或通过PGC-1α间接激活核呼吸因子调节线粒体的生物发生、线粒体稳态和线粒体的融合与裂解，从而缓解线粒体损伤进而减轻线粒体损伤与炎症反应、氧化应激之间的级联反应，并且通过促进SOD2、解偶联蛋白2等抗氧化酶的表达清除ROS，保护氧化应激损伤，调节抗氧化和氧化应激之间的平衡[9]。

AR属于中医学“鼻鼽”范畴，主要临床表现为鼻痒、流清涕和打喷嚏。本实验中观察到与空白组相比，AR模型组小鼠毛发枯槁、活跃度下降，其主要病机当为肺气虚寒、脾肾阳虚。麻黄细辛附子汤出自《伤寒论》，方中麻黄发汗解表，附子温补肾阳，细辛沟通表里，三药合用，温少阴之经而发太阳之表，临床治疗AR优势突出。本课题组的前期研究证明，麻黄细辛附子汤能通过恢复辅助性T细胞1/辅助性T细胞2平衡发挥治疗AR的作用[10-11]。线粒体是真核生物重要的供能细胞器，ATP驱动的嘌呤能炎症体信号通路是一种危险的信号级联，会加重炎性反应[12]，本实验则从线粒体氧化应激的角度入手，探讨麻黄细辛附子汤治疗AR的作用机制。

本实验中与空白组比较，模型组小鼠血清中IgE含量显著升高(P<0.01)且肺组织病理表现出典型的炎性改变，说明造模成功。SOD是机体中广泛存在的一种清除氧自由基的抗氧化酶，MDA是过氧化的主要产物，其异常表达会加重线粒体膜的损伤程度。本实验的结果显示，麻黄细辛附子汤可以升高SOD活性，降低MDA含量，并可以增加ATP含量、呼吸链复合物Ⅳ活性，修复线粒体的超微结构，说明该方可以减轻线粒体的氧化应激损伤。进一步探讨其抗氧化机制，发现麻黄细辛附子汤可以上调AMPKα2和p-AMPK(Thrl72)蛋白的表达，PGC-1α蛋白表达虽有增加但不具有统计学意义，可能麻黄细辛附子汤通过缓解线粒体氧化应激损伤发挥治疗AR的作用除了AMPK、p-AMPK(Thrl72)蛋白之外还有其他的靶点蛋白，需要进一步展开实验研究。

本实验发现氧化应激损伤与线粒体能量代谢可以通过AMPKα2和p-AMPK(Thrl72)蛋白建立正反馈联系。中医学的“气”可能与线粒体具有一定的关系[9,13-14]，线粒体的能量代谢有可能是“阳气”的现代生物学基础依托。麻黄细辛附子汤可能通过缓解线粒体氧化应激损伤，保护线粒体结构和能量代谢功能从而发挥温补脾肾经阳气治疗AR的作用。本研究为线粒体与“气”之间的关系及扶阳作用的生物学基础提供了一定的实验依据。