雪茄烟叶精油主要成分分析及作用评价

徐秀娟，鲁 平，史清照，陈孟起，杨春强，屈 展，崔 凯，李明哲,何保江*，胡少东*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001

2.河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州经济技术开发区第三大街8号450000

雪茄烟是全部用雪茄烟叶卷制成的卷烟产品，抽吸时具有典型的雪茄风格，具体表现为香气量足、吃味好、微苦，余味舒适，烟气烟碱释放量高，劲头较大，烟气成碱性［1］。近年来，我国雪茄烟市场持续升温，特别是高档雪茄烟需求量不断增加，发展前景良好。

与卷烟相比，雪茄烟仅由5种左右的烟叶原料组成，因而烟叶品质对产品的质量影响极大。与进口雪茄烟叶相比，国产雪茄烟叶化学成分（总氮、总植物碱、钾、氯等）的组成存在显著差异，感官质量整体偏低，特征香味较弱，香气浓度不足，劲头偏大，杂气明显，苦味和涩味较重［2-6］，难于满足雪茄烟产品配方需要，国内烟草行业中高端雪茄烟的茄衣、茄套、茄芯原料基本依赖进口。国内雪茄烟起步较晚，目前对雪茄烟叶的研究主要集中在品种选育、栽培、调制、发酵以及常规化学成分分析等方面，对于雪茄烟叶致香成分的研究较少［7-10］。赵瑞等［11］研究了国内外不同雪茄烟茄芯原料主要化学成分与感官品质之间的关联；王玉华等［12］分析了国内外不同产区雪茄烟茄芯原料中的部分中性致香成分并进行相关性分析，发现类胡萝卜素降解产物与新植二烯的相关性密切（相关系数为0.98）；李浩等［13］分析了四川不同产区雪茄烟叶的理化指标和致香成分的质量分数，并与印尼雪茄烟叶进行对比，结果表明，四川雪茄烟叶新植二烯和香叶基丙酮质量分数高于印尼，其他质体色素降解产物总量较低。香味成分是烟叶风味特征的重要物质基础，与烟叶香气质量关系密切，针对烟草香气成分的分析研究早已成为烟草化学研究的热点之一。然而，雪茄烟叶的致香成分及其与感官质量的关系研究鲜见文献报道。为此，采用亚临界萃取和分子蒸馏技术制备雪茄烟叶精油，并进行成分分析，探明蒸馏温度对烟碱、酮类、酯类、有机酸类等成分富集效果的影响，以及不同蒸馏温度下烟草精油的感官作用差异，为雪茄烟叶特征致香成分的定向富集提供理论基础；采用简单相关分析方法对雪茄烟叶部分致香成分与卷烟感官评价指标进行关联，找出对烟叶香气质量影响较大的致香成分因子，为雪茄烟叶的质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

雪茄烟叶（建恒4号，由河南中烟工业有限责任公司提供）；参比卷烟：“红旗渠”（雪茄）卷烟，卷烟纸为白色未加香。

乙酸苯乙酯［色谱纯，阿拉丁试剂（中国）有限责任公司］；液氮（河南源正科技发展有限公司）；食用乙醇（AR，新乡酒精厂）；二甲醚（AR，中油化工有限责任公司）；尼龙66滤膜（0.22 μm，天津津腾公司）。

CP224S型电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）；R-210旋转蒸发仪（瑞士Büchi公司）；7890GC-5977MS气质联用色谱仪（美国Agilent公司）；DLSB-5/20低温冷却循环泵（郑州长城仪器有限公司）；HH-ZKYY多功能油浴锅（巩义市予华仪器有限公司）；PL6500低温冰箱（美国Thermo Fisher公司）；CBE-5L型亚临界溶剂小样处理设备（河南省亚临界生物技术有限公司）；SY-Ⅲ-A型实验用烟草处理机（河南富邦实业有限公司）；FW-200型中药粉碎机（浙江永康帅通工具有限公司）；KDL 5分子蒸馏仪（德国UIC公司）。

1.2 方法

1.2.1 雪茄烟叶精油的制备

亚临界萃取法：将烟叶粉碎后装入孔径75 µm（200目）样品袋中，送入萃取罐中，再加入95%乙醇作为夹带剂（用量为二甲醚的0.05倍），抽真空并向萃取罐内注入萃取溶剂二甲醚，控制料液比m烟粉∶m二甲醚=1∶20，萃取温度为30℃，萃取时间为20 min，萃取3次。萃取结束后，减压脱除溶剂，得到粗提物。在搅拌下向烟草浸膏中缓慢倒入10倍量的95%乙醇，加热至50℃，保持40 min使其充分溶解。待溶液冷却至室温后，转移至-20℃冰箱中冷冻过夜。抽滤后，在0.01 MPa、浴温35℃条件下将滤液浓缩至无溶剂，得到雪茄烟叶净油1#样品，产率5.2%。

分子蒸馏法：①称取158.9 g雪茄烟叶净油1#样品，在蒸馏温度60℃、压力0.1 Pa、进料速度1.5 mL/min、搅拌速度160 r/min条件下，分别收集轻、重组分；②将收集到的重组分进行二级蒸馏，蒸馏温度为80℃，分别收集轻、重组分；③将收集到的重组分进行三级蒸馏，蒸馏温度为100℃，收集轻、重组分；④将重组分进行四级蒸馏，蒸馏温度为120℃，收集轻、重组分。经上述逐级蒸馏后共得到4个轻组分样品，分别为2#（60℃，5.2 g）、3#（60~80℃，3.16 g）、4#（80~100℃，2.88 g）、5#（100~120℃，4.44 g），以及120℃重组分（6#，104.56 g）。

1.2.2 雪茄精油成分分析

雪茄精油成分分析以乙酸苯乙酯为内标，采用半定量的方法进行分析。分别称量100 mg样品，用乙醇溶解并定容至5 mL，加入100 μL 5.43 mg/mL乙酸苯乙酯的无水乙醇溶液作为内标，进行GC/MS分析。分析条件：

色谱柱：DB-WAXetr毛细管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度：250℃；载气：高纯氦气，流速1.0 mL/min；进样量：1 μL；分流比：10∶1；程序升温电离方式：EI；离子源温度：230℃；电子能量：70 eV；四极杆温度：150℃；电子倍增器电压：1.89 kV；质量扫描范围：33~500 amu；扫描方式：全扫描；溶剂延迟：10.0 min。

1.2.3 感官评价

挑选质量为（0.815±0.07）g、吸阻为（1 100±200）Pa的空白卷烟样品，将1#~6#样品均用95%食用乙醇稀释至质量浓度为10%，用毛笔均匀刷涂于卷烟纸上，涂布量为烟支质量的0.3%（湿重）。涂布完毕后，将卷烟装入烟盒中，密封于（22±2）℃和相对湿度（RH）（60±5）%的条件下放置1周。感官评价方法借鉴GB 15269.4—2011［14］和YC/T 497—2014［15］，结合雪茄烟的风格特征，制定了包含品质特征、味觉特征和风格特征共计23项指标的评价表，其中品质特征包含香气、丰浓、杂气、刺激和细柔；味觉特征包含酸味、甜味、苦味和综合味觉；风格特征包含干草香、树脂香、木香、辛香、焦香、可可香、烘焙香、奶香、酸香、豆香、蜜甜香、果香和花香。请7位已取得卷烟感官评吸资格证书的专业人员根据拟定的感官特征评价表进行评价，感官评价结果采用算术平均值进行统计。

1.2.4 相关分析

采用SPSS 18.0软件对部分化学成分和感官指标进行简单相关分析，P＜0.05为显著相关，P＜0.01为极显著相关。用于相关分析的化合物有甲酸、乙酸、丙酸、2-甲基丙酸、丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基-2-丁烯酸、戊酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、正己酸、壬酸、苯甲酸、苯乙酸、6-甲基-5-庚烯-2-酮、对甲基苯乙酮、乙酰丙酮、二氢-β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、金合欢基丙酮、3-羟基-β-二氢大马酮、4-乙基吡啶、2，3'-联吡啶、（E）-橙花叔醇、罗汉柏烯、西柏烯、新植二烯、5-乙酰氧基甲基-2-呋喃甲醛、苯乙醇、3，5，5-三甲基-4-（3-羟基-1-丁炔基）-2-环己烯-1-醇、二氢猕猴桃内酯、（6R，7E，9R）-9-羟基-4，7-巨豆二烯-3-酮，共34种。根据雪茄烟香气丰富浓郁，口感舒适，蜜甜香、酸香、木香等香韵突出的风格特征，在进行相关性分析时，重点考察香气、丰浓、综合味觉、木香、酸香、烘焙香和蜜甜香等指标。

2 结果与讨论

2.1 雪茄烟叶精油成分分析及感官作用评价

目前，挥发性植物精油的富集方法主要有水蒸气蒸馏法、压榨法、溶剂提取法，以及新兴的超临界萃取法、亚临界萃取法等［16］。水蒸气蒸馏法是根据植物挥发油中各组分蒸汽压差异，将挥发油与水蒸气一起蒸馏而出，需在较高的温度下进行，且提取时间长，容易造成热敏性、易水解物质的热分解，导致部分有效成分损失。溶剂萃取法在提取植物精油时，需使用有机溶剂，提取时间长，提取物需进一步浓缩，易导致部分挥发油损失。与传统提取方法相比，超临界萃取和亚临界萃取法均是利用温度和压力的变化改变流体溶解能力，使溶质和溶剂分离，从而一步化实现萃取分离。与超临界萃取相比，亚临界萃取的操作压力较低，且可在室温或更低的温度下萃取，最大化地保护热敏性成分不被破坏［17］。因而，本研究中采用亚临界萃取法，以二甲醚为溶剂，95%乙醇为夹带剂萃取雪茄烟叶；采用乙醇溶解、低温冷冻的方式脱除植物蜡质，得到雪茄烟叶净油。为进一步实现致香成分的富集，采用分子蒸馏技术在60~120℃条件下逐级分离，得到4种雪茄烟叶精油，其物理形态及产率如表1所示。4种精油中，2#的产率最高，4#的产率最低；且随蒸馏温度的升高，精油的流动性减弱，由可流动的液体逐渐转变为不可流动的黏稠物。这与组分中高沸点大分子物质的质量分数逐渐增大有关。

表1 2#~5#精油样品的分离温度、产率及物理状态Tab.1 Distillation temperatures,yields and physical properties of essential oil samples 2#-5#

对1#~5#精油样品进行GC-MS分析，结果见表2。共鉴定出126种化合物，主要包括烷烃23种、烯烃26种、有机酸17种、酮类化合物22种、醇类化合物17种、含氮杂环化合物10种、酯类化合物6种等。整体而言，与烤烟类似，质量分数最高的为烟碱和新植二烯，2#精油中烟碱质量分数高达188.35 mg/g，3#精油中新植二烯的质量分数最高（551.20 mg/g）。随蒸馏温度的变化，各精油样品的物质组成及质量分数均有较大差异，其中2#精油中鉴定出的成分多达109种，而5#精油仅有44种。从总量上看，1#精油的挥发性成分质量分数较低，仅为176.84 mg/g；随蒸馏温度的升高，挥发性物质的总量先升高后降低，其中3#高达原样的4.98倍（880.38 mg/g）。这表明，分子蒸馏法能够有效富集挥发性致香成分，且雪茄精油的挥发性物质主要集中在100℃以下的流份中，100℃以上的挥发性成分的总量较低。蒸馏温度较低时，低沸点、弱极性的烷烃、烯烃类物质被富集，2#精油中烷烃的种类最多（21种）、质量分数最高（共计9.94 mg/g）；烯烃也多达23种，质量分数以新植二烯为主。随蒸馏温度的升高，高沸点物质的质量分数逐渐增大，如亚麻酸、亚油酸在5#样品中质量分数最高。1#~5#样品中各类物质组成如表3所示，总体而言，醇类、酮类、有机酸、烯烃（不含新植二烯）的质量分数较高，酯类、烷烃、含N杂环（不含烟碱）、含S杂环及苯系物的质量分数较低。不同蒸馏温度下有机酸的总量变化不大，最高的为5#（25.52 mg/g），最低的为2#（13.97 mg/g）；而酮类和醇类的差别较大，其中酮类成分质量分数最高的达47.17 mg/g（3#），最低的仅为6.86 mg/g（5#）；醇类质量分数最高的4#样品是最低的2#的5.65倍。

表2 （续）

表2 （续）

表2 雪茄烟叶精油的GC-MS分析结果Tab.2 GC-MS analysis results of essential oil of cigar tobacco

表3 雪茄精油中各类致香成分组成Tab.3 Composition of different kinds of aroma components in essential oil of cigar tobacco （mg·g－1）

此外，各类致香成分质量分数随温度的升高，其变化趋势也不同（图1）。烷烃类、酯类和含N杂环成分的质量分数随蒸馏温度的升高而降低，烯烃类、酮类和醇类成分先升高后降低，有机酸类物质随蒸馏温度的升高而升高。由表2可知，小分子有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、苯甲酸和苯乙酸等多在80℃以下被蒸出，而高碳脂肪酸，如亚麻酸、亚油酸等在高于80℃的馏分中质量分数较高。由此可见，有机酸的质量分数随蒸馏温度的升高而增大主要是由亚麻酸、亚油酸质量分数的增加引起的。小分子有机酸通常具有酸香、甜香，可改善烟气吃味，如3-甲基戊酸可增加甜味，似乳酪，水果香味［18］；而长链有机酸会增加烟气蜡味、刺激性。由此可见，调节蒸馏温度会影响精油中有机酸的组成，在较低的温度下可富集对卷烟烟气酸香起重要作用的成分，降低长链脂肪酸的质量分数。

图1 雪茄烟叶精油中各种类致香成分的组成Fig.1 Composition of different kinds of aroma components in essential oil of cigar tobacco

烟碱质量分数高低对提取物的感官品质影响显著，因而如何调控烟碱质量分数尤为重要。含N杂环主要由烟碱、麦斯明、二烯烟碱、2，3'-联吡啶等组成，其中烟碱占总量的91.15%~95.55%。蒸馏前，1#样品中烟碱质量分数仅为39.00 mg/g，蒸馏后质量分数高达原来的4.8倍（2#）。随蒸馏温度的升高，烟碱质量分数逐渐降低，当蒸馏温度为120℃时，烟碱质量分数降低至34.69 mg/g。烷烃类成分与烟碱的变化趋势相同，均随蒸馏温度的升高而降低。当蒸馏温度为60℃时，烷烃的质量分数是1#样品的1.83倍；而当蒸馏温度升高时，烷烃的质量分数和种类均大大降低，其中，3#样品烷烃质量分数最低。

酮类成分的质量分数随蒸馏温度的升高先增加后降低，3#样品的最高。酮类成分中含大量烟草特征致香成分，如巨豆三烯酮、金合欢基丙酮、β-紫罗兰酮、3-羟基-β-二氢大马酮等，其质量分数高低对精油的感官质量影响较大。3#样品中，金合欢基丙酮的质量分数高达13.43 mg/g；但随蒸馏温度的升高，5#样品中仅为1.60 mg/g，降低了88.11%。由表2可知，酯类成分中，除长链脂肪酸酯外，二氢猕猴桃内酯对卷烟香气的贡献较大，该成分随蒸馏温度的升高而降低，且在80℃时被完全蒸出。而长链脂肪酸酯在高沸点组分中的质量分数较高。

由此可见，在烟草提取物分离时，为了降低烷烃、烟碱等的质量分数，同时有效富集关键致香成分，可以先采用较低的蒸馏温度去除大部分烷烃及部分烟碱，再次蒸馏降低长链脂肪酸酯的质量分数，从而提高关键致香成分的质量分数。为验证该方法对烟草提取物品质改善的实际效果，将所有样品等量涂布于参比卷烟上，进行感官作用评价，结果如表4所示。

表4 1#~5#雪茄精油应用在参比卷烟上的感官评价得分①Tab.4 Sensory evaluation scores of cigar essential oil samples No.1#-5# when applied to reference cigarettes

品质特征方面，与空白卷烟相比，所有样品均能较好地提高香气，增加烟气浓度，使烟气细柔回甜；与未蒸馏样品1#相比，2#和3#对提高卷烟感官品质有显著作用，不仅可增浓烟香，还可降低烟气杂气与刺激性，改善口腔舒适性。随着蒸馏温度的升高，样品4#和5#对香气和浓度的改善弱于1#，且杂气和刺激性增大，综合味觉变差。风格特征方面，雪茄烟叶精油对卷烟香气风格的改善主要体现在干草香、焦香、烘焙香、奶香、酸香和蜜甜香，与样品1#相比，3#的焦香、可可香、烘焙香、酸香和蜜甜香均有改善，5#的干草香、木香有明显改善。整体而言，3#（60~80℃轻组分）对品质和香气风格的改善均较好，能够增加香气量，增加烟气浓度，较好地凸显雪茄风格特征，这与成分分析的结果相吻合。

2.2 部分致香成分与感官指标的相关分析

为进一步探究对感官品质影响较大的雪茄烟叶致香成分因子，选定雪茄感官特征的重点指标香气、丰浓、综合味觉、木香、烘焙香、酸香、蜜甜香，结合参考文献［19-21］，从表2中筛选出34种可能有相关性的化合物，采用简单相关分析方法进行数据处理，有显著相关性的结果见表5。

表5 部分致香成分与雪茄特征指标的相关性①Tab.5 Correlations between some aroma components and cigar characteristic indexes

对香气指标而言，显著正相关影响的因素有香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯、金合欢基丙酮和苯乙酸，显著负相关影响的因素为甲基苯乙酮，这与文献［19］的结论基本一致。综合味觉的极显著相关影响因素较多，如乙酸、丙酸、苯乙酸、香叶基丙酮等9种化合物，这可能与酸类成分可以调节烟碱存在形态，从而改善卷烟口腔舒适性有一定关系。二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮和罗汉柏烯与木香呈显著正相关关系，其中罗汉柏烯是柏木油的重要组成成分，木香香韵明显。对于烘焙香指标，西柏烯和3-甲基戊酸分别是显著正相关和负相关影响因素；4-甲基戊酸、正己酸是极显著负相关影响因素，该结果与理论知识差异较大，这可能与烘焙香物质的种类较少、质量分数较低有关，同时本研究中所采用的评价方法，对香气指标的打分分值差距较小，也可能导致相关性结果出现一定的偏差。乙酸、3-甲基丁酸、3-甲基戊酸和（E）-橙花叔醇是蜜甜香的显著正相关影响因素，4-甲基戊酸、2-甲基-2-丁烯酸是极显著正相关影响因素。

3 结论

①低温蒸馏（60~80℃），可降低烟碱、烷烃以及长链脂肪酸酯的质量分数，实现致香成分的有效富集；②与卷烟香气密切相关的成分有香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯、金合欢基丙酮和苯乙酸等；③与综合味觉密切相关的成分有乙酸、丙酸、正己酸等，其中，香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、苯乙酸均与香气显著正相关，与综合味觉极显著正相关，这些成分可以作为雪茄烟叶精油质量评价的主要指标。