烟草根结线虫病防治药剂对根际土壤细菌群落结构的影响

黄 阔，叶长文*，李 栋，李青常，贺 琛，杨国涛，王 勇，龙 岗，丁 伟

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001

2.西南大学植物保护学院，重庆市北碚区天生路2号400715

3.四川省烟草公司凉山州公司，四川省西昌市山岔东路478号615000

4.凉山州烟草公司会理分公司，四川省会理县顺城东路68号615100

烟草根结线虫病是由根结线虫侵染所引起的土传病害［1］，在世界范围内发生范围广、危害重、防治难［2］，严重影响烟叶的品质和质量，造成巨大的经济损失［3］。

目前生产上烟草根结线虫病防治仍然以化学药剂为主，常采用质量分数为0.5%的阿维菌素、质量分数为10%的噻唑膦或质量分数为20%的丁硫·克百威等，于移栽期穴施或者生长期灌根。化学药剂防效虽好，但靶向性较差，易破坏烟田土壤生态平衡，还可能造成烟叶农残超标，根结线虫抗药性增强。研究表明，枯草芽孢杆菌［4］、荧光假单胞杆菌［5］、淡紫拟青霉［6］、哈茨木霉［7］等微生物菌剂作为植物根际促生菌，能够通过改变根际微生物群落结构，促进微生物对碳源的代谢能力，同时抑制病原菌繁殖，促进植物生长，且对烟草根结线虫病具有一定的防治效果［8-9］。然而，关于防治烟草根结线虫病的药剂处理对烟株根际细菌群落结构的影响和优势菌群的变化情况鲜见报道。为此，本研究中采用16S rRNA高通量测序技术，分析了防治烟草根结线虫病药剂处理后烟株的根际细菌微生物群落结构和优势菌群的变化，旨在探究药剂处理对根际细菌群落的稳定性、优势菌群及差异菌群的影响，探明药剂调控的关键生物因子，为农业生产中有效防治烟草根结线虫病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地情况

供试品种为红花大金元，由四川省凉山彝族自治州会理县益门烟叶工作站提供。

试验地位于四川省凉山彝族自治州会理县益门镇大磨村2组试验烟田，海拔2 110 m、经度E102°16'56''、纬度N26°49'44''，地块平整，试验田连续3年发生根结线虫病。

试验地面积为0.2 hm2，土壤类型为红壤。土壤基本理化性状：pH 5.0、有机质36.9 g/kg、全氮1.99 g/kg、全磷1.27 g/kg、全钾15.9 g/kg、碱解氮176 mg/kg、有效磷26 mg/kg、速效钾400 mg/kg。

1.2 试验设计

试验地于2018年4月18日开始移栽，移栽当天进行施药处理。

试验设7个处理，每处理3次重复，共21个小区，每小区面积为72 m2（约120株烟），两边设置保护行。本试验中各供试药剂的亩（667 m2）用量，是在综合考虑药剂推荐用量、活孢子浓度、有效成分含量等因素后确定的。药剂在移栽时拌土穴施或兑水灌根（见表1）。

表1 各处理编号及处理措施Tab.1 Numbers and measures of treatments

1.3 样品采集

于烟草成熟期（移栽后120 d），采集试验小区的各处理根际土壤样品。采用五点取样法，每个处理小区随机选择5株烟草，挖出完整的根系，轻轻抖去表层土后用细毛刷轻扫附着在根上的土壤，样品分别标记为HL1、HL2、HL3、HL4、HL5、HL6、HL7。将土壤过2 mm网筛以除去杂物，装入1 000 mL无菌塑料袋中，一式3份手动混合均匀，24 h内完成运输，并保存于西南大学微生态过程与调控实验室2~4℃冰箱中。

1.4 DNA提取、PCR扩增和测序

对于每个土壤样品，使用FastDNA™SPIN土壤试剂盒（美国MP Biomedicals公司）从0.5 g土壤中提取总DNA。使用ThermoFisher Scientific（美国Multiskan GO公司）酶标仪测量基因组DNA浓度和纯度。上游引物515F：5’-GTGCCAGCMGCC GCGGTAA-3’，下游引物806R：5’-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3’；PCR的反应总体积为20 μL。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环27次；72℃延伸10 min。使用质量分数2%的琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。标记PCR产物并委托上海美吉生物医药科技有限公司进行IlluminaMiSeq测序［10］。

1.5 数据处理

使用QIIME v1.7.0对原始Illuminafastq数据文件进行解复用、质量过滤和分析。操作分类单元OTU（Operational taxonomic unit）选择具有97%成对同一性的阈值。丰度比较时，使用基于分类法的OTU并通过Origin 9.0软件进行直方图分析。

t检验（P＜0.05）分析样本中的差异物种，找到显著的微生物类群（相对丰度＞1%）。线性判别分析LDA（Linear discriminant analysis）效应大小LEfSe（Linear discriminant analysis effect size）采用Kruskal-Wallis秩和检验（α=0.05）来识别类别之间具有显著差异丰度的分类群，然后使用LDA值估计每个差异丰富特征的效应大小（LDA＞2.0）。

使用SPSS 17.0软件进行单因素ANOVA方差分析（Analysis of Variance）以及Duncan显著性检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 α多样性分析

通过对各处理进行OTUs（97%）、Chao指数、Shannon指数、Coverage指数的分析（表2），荧光假单胞杆菌（HL4）与阿维·丁硫（HL6）处理后，OTU数量、物种丰富度、多样性之间均有显著性差异。7个处理的Coverage指数（物种覆盖度）无差异。

表2 不同土壤样本的细菌α多样性分析Tab.2 Analysis of bacterial alpha diversity for different soil samples

2.2 物种组成

2.2.1 不同分类水平细菌群落数量分布

在所有样本中被检出的4 325个细菌OTU中，分别被分到36个门、89个纲、194个目、371个科、686个属、1 329个种。

从各分类水平的细菌群落数量来看（表3），淡紫拟青霉（HL3）处理后细菌群落的多样性更加丰富，阿维·丁硫（HL6）处理后细菌群落的多样性降低。各处理间的物种OTU数量无明显变化规律。

表3 各处理不同分类水平细菌群落数量Tab.3 Number of bacterial communities at different classification levels in each treatment （个）

2.2.2 门水平群落组成

在门水平上，各处理中平均相对丰度≥1%的细菌类群共有9个（图1）。所有土壤样品中的主要细菌门是变形菌门（Proteobacteria），其次是放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria），它们在各样本中的平均相对丰度分别为35.13%、23.12%、13.84%、8.97%，在各样本中共占总丰度约74%（图1）。

图1 细菌群落组成（门水平）Fig.1 Bacterial community composition（at phylum level）

2.2.3 属水平群落组成

在属水平上，各处理中平均相对丰度≥1%且为已知物种的共有14个（图2）。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）在各处理中所占比例最高，其平均相对丰度为5.67%。通过Silva数据库（http：//www.arb-silva.de）对比，在已知的属水平上，所占比例依次为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，3.62%~6.81%）、芽 单 胞 菌 属（Gemmatimonas，2.58%~4.01%）、Pseudarthrobacter（1.53%~9.58%）、Bryobacter（1.44%~3.21%）、根瘤菌属（Bradyrhizobium，1.60%~2.63%）、Pseudolabrys（1.36%~1.85%）、链霉菌属（Streptomyces，1.52%~2.13%）、Variibacter（1.48%~1.74%）、马 赛 菌 属（Massilla，1.60%~1.68%）、Acidibacter（0.51%~1.47%）、芽生球菌属（Blastococcus，0.62%~1.12%）、克 洛 斯 氏 菌 属（Crossiella，0.45%~1.19%）、粘液杆菌属（Mucilaginibacter，0.17%~1.22%）、Chryseolinea（0.16%~1.31%）。

图2 细菌群落组成（属水平）Fig.2 Bacterial community composition（at genus level）

2.3 β多样性分析

β多样性分析可以用来比较各处理之间微生物群落构成，用于确定各处理间的群落差异关系。在OTU水平，对各样本进行层级聚类分析，和对照相比，不同处理之间的距离较远，重复之间距离相近（图3），可以进一步分析不同群落之间的细菌群落差异。

图3 各样本层级聚类分析（OTU水平）Fig.3 Hierarchical cluster analysis of samples（at OTU level）

在OTU水平上将7个处理进行PCoA分析（图4），不同颜色代表不同处理条件下的样本组，图中的箱线图代表不同组样本在PC1轴上的分布离散情况。其中淡紫拟青霉（HL3）处理较其他处理离散距离最远，分布情况最为明显。表明淡紫拟青霉处理相较于其他处理的细菌群落差异性更大。

图4 OTU水平上各样本PCoA分析Fig.4 PCoA analysis at OTU level for each sample

2.4 差异性分析

使用LEfSe分析检测具有显著丰度差异的类群，并采用线性判别分析（LDA）来估算每个组分（物种）相对丰度对差异效果影响的大小。在能够检测到的属水平上（排除Norank和Unclassified的类群）各样本之间LDA值＞2.0的细菌类群中，HL1有9个，HL2有8个，HL3有37个，HL4有9个，HL5有9个，HL6有10个，HL7有10个。各处理LDA值前3名的类群见表4。

表4 不同处理土壤样本在属水平上LDA值排序前3位的物种Tab.4 Top three species in LDA value at genus level for soil samples under different treatments

组间差异显著性检验结果表明，在属水平上（排除Norank和Unclassified的类群），丰度在前10的物种类别及其分别在各样本中的相对丰度见图5，分别为：鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、Bryobacter、慢 生 根 瘤 菌 属（Bradyrhizobium）、Pseudolabrys、链霉菌属（Streptomyces）、Variibacter、马赛菌属（Massilia）、芽生球菌属（Blastococcus）。

图5 表明，假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、马赛菌属（Massilia）、芽生球菌属（Blastococcus）4个属在各样本中具有显著性差异。在各处理中的相对丰度分别如图6所示。假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、马赛菌属（Massilia）在阿维·丁硫处理（HL6）时相对丰度最高，链霉菌属（Streptomyces）、芽生球菌属（Blastococcus）在哈茨木霉处理（HL5）时相对丰度最高。

图5 属水平上各样本的组间差异显著性检验Fig.5 Significance test of differences between groups of each sample at genus level

图6 4个属在各处理中的丰度差异Fig.6 Abundance differences of four genera under each treatment

3 讨论

已有研究表明，土壤中添加化学药剂后细菌群落的物种丰富度和多样性均显著下降，且在一定时期内波动幅度较大，细菌群落稳定性降低［11-13］。张保国等［14］和赵静等［15］研究表明，化学药剂能够明显改变微生物的群落结构和组成，减少微生物的生物量，这与本研究中所发现的化学药剂阿维·丁硫处理烟草根部，根际土壤中细菌群落的物种数量、丰富度和多样性明显降低的结果一致。此外，本研究中发现枯草芽孢杆菌和荧光假单胞杆菌处理后细菌群落的物种丰富度和多样性显著提升，且淡紫拟青霉处理也能够提高物种多样性。据报道，枯草芽孢杆菌可以提高土壤细菌群落的物种多样性和丰富度指数，提高群落结构稳定性［16-17］；荧光假单胞杆菌能够提高土壤微生物功能多样性［18-20］；淡紫拟青霉也能够提高根际土壤中细菌群落的物种多样性［10，21］，且肖顺等［22］、刘晓莉［23］、乔月静［24］均研究表明淡紫拟青霉处理能够提高根际土壤中真菌和细菌群落的物种多样性，使得细菌群落结构更加稳定。上述报道均与本研究结果一致。

对优势细菌类群进行分析发现，各处理间优势物种的相对丰度差异不大。在门水平，变形菌门（Proteobacteria）是所有土壤样品中的主要细菌门，其次是放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria）。付琳等［25］发现根际土壤中优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）；赵帆等［26］发现根际土壤中优势菌种也包含变形菌门（Proteobacteria），放线菌门（Actinobacteria）。以上研究中部分优势菌群与本研究结果一致。本研究中在属水平的分析结果表明，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和芽单胞菌属（Gemmatimonas）是优势菌属。这与姚城城等［27］发现果园土壤微生物群落的组成中芽单胞菌属（Gemmatimonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、类似牙球菌属（Blastocatella）是优势菌属的结论基本一致，表明根际土壤中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和芽单胞菌属（Gemmatimonas）是其优势菌属。

不同药剂处理会对根际土壤细菌群落结构产生较大影响［28-29］。本研究结果表明，田间药剂处理烟草根结线虫病后，假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、马赛菌属（Massilia）、链霉菌属（Streptomyces）和芽生球菌属（Blastococcus）在各处理中的相对丰度多组比较具有显著性差异。其中假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、马赛菌属（Massilia）在阿维·丁硫处理后相对丰度最高，链霉菌属（Streptomyces）、芽生球菌属（Blastococcus）在哈茨木霉处理后相对丰度最高。李苗等［30］、李娟等［31］、杨恩东等［32］对假节杆菌属（Pseudarthrobacter）和马赛菌属（Massilia）进行研究，发现其与土壤性质密切相关。链霉菌属（Streptomyces）作为产生抗生素等生物活性物质种类最多的一类微生物［33-34］，芽生球菌属（Blastococcus）作为稀有放线菌属［35-36］，它们在抗逆机制研究、环境修复治理等方面均表现出潜在优势。以上研究表明，本研究中发现的4种差异菌属在土传病害防控和土壤修复调控过程中均有潜在价值。

4 结论

药剂处理后根际土壤细菌群落结构变化较大，化学药剂能够降低细菌群落稳定性，生防菌剂能够提高细菌群落的物种丰富度和多样性，其中枯草芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、淡紫拟青霉对根际细菌群落结构稳定的促进效果最为明显。各药剂处理对根际土壤细菌组成中优势物种的影响不大，优势菌门主要是变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria），平均相对丰度分别为35.13%、23.12%、13.84%、8.97%。优势菌属主要是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和芽单胞菌属（Gemmatimonas），平均相对丰度分别为5.67%和3.29%。各药剂处理后根际土壤中假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、马赛菌属（Massilia）、芽生球菌属（Blastococcus）的相对丰度都存在显著性差异。