甘磷酸胆碱原料药中3种遗传毒性杂质含量测定方法的建立

2021-11-24张伟奇王倩何燕王雪芹

中国药房 2021年21期

张伟奇　王倩　何燕　王雪芹

中图分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）21-2631-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.21.12

摘要目的：建立氣-质联用（GC-MS）法同时测定甘磷酸胆碱原料药中环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇等3种遗传毒性杂质的含量。方法：以4批甘磷酸胆碱原料药为检测样品。色谱柱为ZB-WAXplusTM;进样口温度为200 ℃;进样方式为不分流进样;载气为氦气（He），恒流模式;程序升温为初始温度30 ℃保持1 min，然后以30 ℃/min的速率升温至220 ℃并保持5 min;进样量为1 μL。离子源为电子轰击源（EI），电离电压为70 eV，离子源温度为200 ℃;质谱传输接口温度为250 ℃;质谱监测模式为选择离子（SIM）;检测特征离子为环氧氯丙烷[质荷比（m/z）49、57、62]、缩水甘油（m/z 31、43、44）、3-氯-1，2-丙二醇（m/z 44、61、79）;溶剂延迟时间为3 min。结果：环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇检测的质量浓度线性范围分别为29.86～746.48、172.91～922.18、21.18～211.85 ng/mL（r均大于0.999 0）;检测限分别为19.91、115.27、10.59 ng/mL;定量限分别为29.86、172.91、21.18 ng/mL;精密度（n=6）、重复性（n=6）、稳定性（室温放置12 h，n=8）试验的RSD均小于10%;平均加样回收率分别为93.88%、91.45%、91.86%，RSD分别为5.10%、3.10%、2.49%（n=9）。在4批甘磷酸胆碱原料药中，均未检出上述3种遗传毒性杂质。结论：建立的GC-MS法简单高效、准确度高、重复性好，可用于同时测定甘磷酸胆碱原料药中环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇等3种遗传毒性杂质的含量。

关键词气-质联用法;甘磷酸胆碱;环氧氯丙烷;缩水甘油;3-氯-1，2-丙二醇

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish GC-MS method for the content determination of three toxic impurities in glycerophosphorylcholine raw materials， such as epichlorohydrin， glycidyl， 3-chloro-1，2-propanediol. METHODS： Four batches of glycerophosphorylcholine raw materials were used as test samples. The determination was performed on ZB-WAXplusTM column， and the injector temperature was 200 ℃; the sample injection adopted splitless injection mode， using helium （He） as carrier gas， in constant current mode; the temperature program for the column was initially heating at 30 ℃ for 1 min， rising to 220 ℃ at a speed of 30 ℃/min then remaining 5 min. The ion source was electrospray ion source （EI）， the ion source temperature was 200 ℃， and the ionization energy was 70 eV; transmission interface temperature was 250 ℃， and mass spectrum monitoring mode was selected ion （SIM）. Detection ions were epichlorhydrin [mass charge ratio （m/z） 49， 57， 62]， glycidyl （m/z 31， 43， 44）， 3-chloro-1，2-propanediol （m/z 44， 61， 79）. The solvent delay time was 3 min. RESULTS： The linear range of epichlorhydrin， glycidyl and 3-chloro-1，2-propanediol were 29.86-746.48， 172.91-922.18， 21.18-211.85 ng/mL， respectively （all r>0.999 0）. The detection limits were 19.91，115.27，10.59 ng/mL， respectively. The limits of quantitation were 29.86， 172.91， 21.18 ng/mL， respectively. RSDs of precision （n=6）， reproducibility （n=6） and stability （placed at room temperature for 12 h， n=8） tests were all lower than 10%. The average recoveries were 93.88%， 91.45%， 91.86%， and RSDs were 5.10%， 3.10%， 2.49% （n=9）， respectively. In the 4 batches of glycerophosphorylcholine raw materials， three toxic impurities were all not detected. CONCLUSIONS： Established GC-MS method is simple， efficient， accurate and repeatable， and it can be used to determine the contents of three toxic impurities in glycerophosphorylcholine raw materials， such as epichlorohydrin， glycidyl， 3-chloro-1，2-propanediol.

KEYWORDS GC-MS method; Glycerophosphorylcholine; Epichlorhydrin; Glycidyl; 3-chloro-1，2-propanediol

甘磷酸膽碱又称甘磷酰胆碱、甘油卵磷脂，是一种人体内天然存在的水溶性磷脂代谢产物，具有提高记忆力、防衰老、降血脂、保肝、健脑等多种功效[1-2]。3-氯-1，2-丙二醇又称3-氯-1，2-二羟基丙烷，是合成甘磷酸胆碱的起始物料，其可能对人体产生肝肾毒性、免疫毒性、遗传毒性、生殖毒性，并具有致癌性[3-5]。环氧氯丙烷、缩水甘油分别为3-氯-1，2-丙二醇合成的起始物料和合成副产物。其中，环氧氯丙烷又称表氯醇、3-氯-1，2-环氧丙烷，因其具有警示结构——环氧结构，故被视为潜在的遗传毒性杂质，具有潜在的致突变性、致畸性和致癌性[6];缩水甘油又称环氧丙醇，相关动物实验证明其具有致癌作用[7]。目前，对于环氧氯丙烷、缩水甘油和3-氯-1，2-丙二醇常见的检测方法为气相色谱（GC）法和气-质联用（GC-MS）法[7-11]。但目前文献报道的方法多是针对食品和环境中这3种遗传毒性杂质的检测，笔者尚未见甘磷酸胆碱化学原料药中上述3种遗传毒性杂质同时测定的文献报道。由于不同样品的基质和检测要求均有差异，既有文献方法不能满足甘磷酸胆碱原料药中上述3种遗传毒性杂质的检测要求。鉴于此，本研究拟建立GC-MS法同时测定甘磷酸胆碱原料药中环氧氯丙烷、缩水甘油和3-氯-1，2-丙二醇等3种遗传毒性杂质的含量，为该原料药的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

Trace DSQ型GC-MS仪（包括FINNIGAN Trace DSQ型质谱仪、Thermo FINNIGAN Trace GC ultra型气相仪、Xcalibur工作站）购自美国Thermo Electron公司;XPE-205型电子天平购自瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 主要药品与试剂

环氧氯丙烷对照品（批号G154861，纯度99.9%）、3-氯-1，2-丙二醇对照品（批号G249657，纯度95.6%）均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;缩水甘油对照品（批号101344-201501，供GC检查用）购自中国食品药品检定研究院;甘磷酸胆碱原料药（批号分别为191001、200101、200102、200103，纯度均为99.8%）购自湖南华纳大药厂股份有限公司;甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ZB-WAXplusTM（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;进样口温度为200 ℃ ;进样方式为不分流进样;载气为氦气（He），恒流模式;程序升温为初始温度30 ℃保持1 min，然后以30 ℃/min的速率升温至220 ℃并保持5 min;进样量为1 μL。

2.2 质谱条件

离子源为电子轰击源（EI），电离电压为70 eV，离子源温度为200 ℃;质谱传输接口温度为250 ℃;质谱监测模式为选择离子（SIM）;检测特征离子为环氧氯丙烷[质荷比（m/z）49、57、62]、缩水甘油（m/z 31、43、44）、3-氯- 1，2-丙二醇（m/z 44、61、79）;溶剂延迟时间为3 min。

2.3 溶液制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备分别取环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇对照品各约10 mg，精密称定，置于不同10 mL量瓶中，分别用甲醇溶解并定容，摇匀，作为各对照品的单一贮备液①。分别精密量取各对照品的单一贮备液①适量，置于不同量瓶中，用甲醇稀释制成各对照品质量浓度均为10 μg/mL的单一贮备液②。分别精密量取各对照品的单一贮备液②适量，置于同一量瓶中，用甲醇稀释制成环氧氯丙烷质量浓度分别为29.86、199.06、248.83、298.65、398.20、497.65、746.48 ng/mL，缩水甘油质量浓度分别为172.91、230.54、345.82、461.09、576.36、691.63、922.18 ng/mL，3-氯-1，2-丙二醇质量浓度分别为21.18、31.78、42.37、52.96、84.74、105.92、211.85 ng/mL的系列混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备精密称定甘磷酸胆碱原料药1 g，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，经0.22 μm滤膜过滤，收集滤液，即得。

2.3.3 空白溶剂以甲醇为空白溶剂。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验分别精密吸取“2.3”项下环氧氯丙烷质量浓度为248.83 ng/mL、缩水甘油质量浓度为345.82 ng/mL、3-氯-1，2-丙二醇质量浓度为42.37 ng/mL的混合对照品溶液以及供试品溶液（批号200101）和空白溶剂，分别按“2.1” “2.2”项下条件进样测定，记录色谱图。结果显示，环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的保留时间分别为4.11、5.30、7.73 min，各待测成分峰均分离良好，无干扰峰，表明该方法的专属性较好。专属性考察的色谱图见图1。

2.4.2 线性关系考察精密吸取“2.3.1”项下系列混合对照品溶液各1 μL，分别按“2.1” “2.2”项下条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分的质量浓度为横坐标（x，ng/mL）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得到环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的回归方程分别为y=100.19x+265.3（r=0.999 7）、y=94.114x-795.22（r=0.999 5）、y=46.85x-296.5（r=0.999 7）。结果表明，环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇检测的质量浓度线性范围分别为29.86～746.48、172.91～922.18、21.18～211.85 ng/mL。

2.4.3 检测限和定量限考察取混合对照品溶液（环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的质量浓度分别为9.95、12.81、10.59 μg/mL，制备方法同“2.3.1”项下），用甲醇逐级稀释，然后按“2.1” “2.2”项下条件进样测定，记录峰面积，以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1分别测得检测限和定量限。结果显示，环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的检测限分别为19.91、115.27、10.59 ng/mL，定量限分别为29.86、172.91、21.18 ng/mL。

2.4.4 精密度试验取“2.3.1”项下混合对照品溶液（环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的质量浓度分别为248.83、345.82、42.37 ng/mL），按“2.1” “2.2”项下条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇峰面积的RSD分别为6.1%、3.3%、5.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性试验取“2.3.1”项下混合对照品溶液（环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的质量浓度分别为248.83 、345.82 、42.37 ng/mL），于室温下放置0、1、2、4、6、8、10、12 h时，分别按“2.1” “2.2”項下条件进样测定，记录峰面积。结果显示，环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇峰面积的RSD分别为8.2%、3.0%、6.5%（n=8），表明该混合对照品溶液在室温下放置12 h内稳定性较好。

2.4.6 重复性试验取同一批甘磷酸胆碱原料药（批号200101）1 g，精密称定，共6份，分别加入环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇对照品单一贮备液②各适量，按“2.3.2”项下方法制备含环氧氯丙烷248.83 ng/mL、缩水甘油345.82 ng/mL、3-氯-1，2-丙二醇42.37 ng/mL的供试品溶液，然后按“2.1” “2.2”项下条件进样测定，记录峰面积，采用外标法计算各杂质的含量并计算其回收率。结果显示，环氧氯丙烷、缩水甘油和3-氯-1，2-丙二醇的回收率分别为90.2%、89.9%、90.9%，RSD分别为7.0%、4.1%、7.1%（n=6），表明本方法的重复性较好。

2.4.7 加样回收率试验取同一批甘磷酸胆碱原料药（批号200101）1 g，精密称定，共9份，置于不同10 mL量瓶中，分别加入各对照品的单一贮备液②适量，并以甲醇为溶剂，分别制备低、中、高浓度的样品溶液（低浓度样品溶液中环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的质量浓度分别为199.06、294.58、33.90 ng/mL，中浓度样品溶液中上述3种成分的质量浓度分别为248.83、358.62、42.37 ng/mL，高浓度样品溶液中上述3种成分的质量浓度分别为298.59、435.47、50.84 ng/mL），每个浓度各3份。分别取上述样品溶液，按“2.1” “2.2”项下条件进样测定，记录峰面积，采用外标法计算各杂质的含量并计算其加样回收率。结果，环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的平均加样回收率分别为93.88%、91.45%、91.86%，RSD分别为5.10%、3.09%、2.49%（n=9），表明本方法的准确度较好。加样回收率试验结果见表1。

2.5 甘磷酸胆碱原料药中3种遗传毒性杂质含量的测定

取4批甘磷酸胆碱原料药（批号分别为191001、200101、200102、200103），分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，然后按“2.1” “2.2”项下条件进样测定，记录峰面积，并采用外标法计算环氧氯丙烷、缩水甘油和3-氯-1，2-丙二醇的含量。结果，4批甘磷酸胆碱原料药中均未检出上述杂质。

3 讨论

3.1 质谱条件的选择

在前期研究中，笔者先在“full scan”扫描模式下对甘磷酸胆碱原料药溶液和环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇对照品溶液进样后的质谱信息进行采集，并通过与NIST质谱数据库进行比对，确定了环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇的出峰时间和特征离子（NIST质谱数据库中没有甘磷酸胆碱的相关信息，故未能确定其色谱峰的出峰时间和特征离子）：环氧氯丙烷的出峰时间为4.11 min，特征离子m/z为49、57、62;缩水甘油的出峰时间为5.39 min，特征离子m/z为31、43、44;3-氯-1，2-丙二醇的出峰时间为7.73 min，特征离子m/z为44、61、79;溶剂（甲醇）的出峰时间为2.2～2.6 min。然后根据上述结果确定SIM采集模式：从运行3 min起开始检测特征离子m/z为49、57、62的质谱信息，从运行4.8 min起开始检测特征离子m/z为31、43、44的质谱信息，从运行6.5 min起开始检测特征离子m/z为44、61、79的质谱信息，溶剂延迟时间为3 min。接着，笔者以3种杂质质量浓度均为500 ng/mL的混合对照品溶液进样测定，发现各待测成分色谱峰的响应信号和峰形均较好，证实了上述检测方式的合理性。

3.2 色谱条件的选择

在前期研究中，笔者分别考察了不同型号色谱柱（DB-5MS色谱柱和ZB-WAXplusTM色谱柱）的分离效果。结果显示，采用DB-5MS色谱柱和ZB-WAXplusTM色谱柱进行分离时，色谱图中均能显示出3种待测成分的色谱峰信息;但使用ZB-WAXplusTM色谱柱进行分离时，所得色谱图中干扰峰相对较少，而在采用DB-5MS色谱柱进行分离时色谱图中缩水甘油的色谱峰出现了明显拖尾现象，故本研究最终选择ZB-WAXplusTM色谱柱进行后续研究。采用GS-MS法进行含量测定时，为了减少基质及其他组分对质谱检测器的污染，在直接进样方式下的进样量首选为1 μL，当此进样量不能满足检测要求时再增大进样量[12]。笔者在前期预实验中发现，当进样量为1 μL时，各待测成分的响应强度已满足检测要求，故本研究选择进样量为1 μL。

3.3 所建方法的合理性分析

按照人用药品注册技术要求国际协调会议（ICH）和2020年版《中国药典》（四部）关于遗传毒性杂质控制的相关要求[12-14]，结合甘磷酸胆碱的临床使用情況（最大日剂量为1.2 g），可计算得环氧氯丙烷的限度为2.46 ppm、缩水甘油的限度为3.56 ppm、3-氯-1，2-丙二醇的限度为0.4 ppm。而本研究所建方法中上述3种杂质的检测限分别为19.91、115.27、10.59 ng/mL（相当于0.019 91、0.115 27、0.010 59 ppm），远低于规定的限度。通过对4批甘磷酸胆碱原料药进行测定，结果均未检出环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇，表明4批原料中3种遗传毒性杂质的含量低于检测限，满足限度控制要求。

综上所述，本研究建立的GC-MS法简单高效、准确度高、重复性好，可用于同时测定甘磷酸胆碱原料药中环氧氯丙烷、缩水甘油、3-氯-1，2-丙二醇等3种遗传毒性杂质的含量。

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