芪黄药对改善糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化的作用及机制探讨*

李雪莹，何春承，邱 伟，黎 明，许禄华，林丰夏，赵贝贝

（1.广州中医药大学附属宝安中医院/深圳市宝安中医院（集团），广东 深圳 518133；2.深圳恒特医学检验实验室，广东 深圳 518000；3.深圳市宝安区人民医院，广东 深圳 518000；4.广州中医药大学研究生院，广东 广州 510006）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是终末期肾脏病的第二位原因，是糖尿病最常见、最严重的并发症之一。既往研究多认为DN的病理改变以肾小球为主，但最新研究发现以成纤维细胞增生、细胞外基质过度沉积为特征的肾间质纤维化亦是DN早期重要的病理改变[1-2]。肾间质纤维化在慢性肾脏病的进展中发挥了关键作用，但具体发病机制复杂，临床尚缺乏有效的治疗手段。中医学认为DN的病理基础以虚为本，以浊瘀为标，治以益气降浊为基本大法[3-4]，中药防治DN具有研究前景[5]。本研究团队前期发现，芪黄药对，即黄芪、大黄组合是益气降浊法治疗慢性肾脏疾病最常用的中药[6]，在延缓慢性肾脏疾病进展方面有明确的临床效果，但目前仍没有文献报道芪黄药对改善DN肾间质纤维化的作用机制。因此本研究拟观察芪黄药对对糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化及炎症因子的影响，利用网络药理学技术探讨可能的机制，并进行验证。

1 材 料

1.1 实验动物 8周龄SPF级Wistar雄性大鼠30只，体质量约180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：11400700344861。大鼠饲养于SPF级动物饲养室，温度22～24 ℃，湿度50%～60%，12 h明暗循环。实验通过深圳市宝安中医院（集团）伦理委员会批准，伦理批件号：2020033102，严格按照相关条例执行。

1.2 药物与试剂 道地药材黄芪（批号：20110105）、大黄（批号：20080312）购自深圳康美药业公司；链脲佐菌素（批号：09171211）购自瑞士Alexis公司；IL-1β ELISA试剂盒（批号：MM-0922R2）、IL-6 ELISA试剂盒（批号：MM-1011M2）、IL-17 ELISA试剂盒（批号：MM-51291H2）、VEGFA ELISA试剂盒（批号：MM-60042O2）、MAPK ELISA试剂盒（批号：MM-70557R2）、TNF-α ELISA试剂盒（批号：MM-0132M2）均购自江苏酶免实业有限公司；α-SMA抗体（批号：GR3241135-2）、山羊抗小鼠抗兔IgG/IgM（批号：GB23303）均购自美国Thermo Fisher公司；血糖监测仪（批号：10131214）及血糖试纸（批号：26001921）购自罗氏诊断产品（上海）有限公司；尿蛋白定量测试盒（批号：AUZ3672）、肌酐测试盒（批号：AUZ3621）、尿素氮测试盒（批号：AUZ3653）均购自深圳爱乐信生物有限公司。

1.3 主要仪器 代谢笼（意大利TECNIPLAST 公司）；SCIENTZ-48高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；全封闭自动脱水机、组织包埋机（深圳达科为公司）；CRYOSTAR NX50型冰冻切片机（美国Thermo公司）；高速冷冻型微量离心机（美国Thermo公司）；BV-2型垂直电泳仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；倒置荧光成像分析显微镜（奥林巴斯有限公司）。

2 方 法

2.1 芪黄药对提取液制备 根据文献方法[7]，黄芪、大黄按2∶1比例粉碎，加8倍量60%乙醇-水浸泡30 min，常压下加热回流提取3次，每次1 h，滤过合并提取液；减压回收乙醇，添加蒸馏水，调pH值至6.5～7.0，并调整至相当于含生药0.5 g/mL。

2.2 网络药理学预测芪黄药对改善糖尿病肾病肾间质纤维化的靶点 TCMSP数据库搜集黄芪、大黄及其化合物成分信息，通过GeneCards获取肾间质纤维化的靶标蛋白，所获得的基因交集使用STRING在线数据库构建PPI网络，通过DAVID在线数据库结合R语言进行GO功能分析和KEGG通路富集分析。

2.3 造模与分组 30只SD大鼠适应性喂养1周后，随机选取10只作为对照组，予水和普通饲料；剩余20只予高糖高脂饲料，并腹腔注射链脲佐菌素（35 mg/kg），造模后监测空腹血糖，当空腹血糖维持大于16.7 mmol/L时即为造模成功。造模成功大鼠随机分为模型组和芪黄药对组，每组10只。

2.4 实验给药 根据芪黄药对成人常规服用剂量（27 g/d），采用人与大鼠的体表面积换算系数计算出大鼠的每日给药剂量为2.8 g/kg，根据大鼠180 g体质量计算为0.51 g生药；芪黄药对提取液浓度为0.5 g/mL，因此每日灌胃量为1 mL。芪黄药对组大鼠每日予以1 mL芪黄药对提取液灌胃1次，正常组和模型组给予等体积的蒸馏水灌胃，连续给药28 d。模型组及芪黄药对组大鼠给予高糖高脂饲料喂养，对照组大鼠予普通饲料喂养。

2.5 观察指标

2.5.1 血尿生化指标检测 大鼠禁食不禁水12 h，取出固定后用剪刀将大鼠尾尖剪去约0.5 cm，将血滴加至血糖试纸上，血糖仪读取数值，干棉球擦净血液并按压止血。每周测量1次血糖。末次给药后将大鼠置入代谢笼内，采集其24 h排泄尿液，计算其24 h尿量并进行尿蛋白定量。腹膜内注射硫喷妥钠（200mg/kg）处死大鼠，取全血标本，室温静置2 h，4 ℃3 000 r/min离心15 min，取上清血清，使用试剂盒检测肌酐和尿素氮。

2.5.2 免疫组化染色与分析 将肾脏组织样品固定在4%多聚甲醛溶液中，冷却，脱水，石蜡包埋及切片。乙醇脱蜡至水，抗原修复，5%的山羊血清室温封闭30 min，加入稀释好的一抗α-SMA（1∶200），4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次后滴加稀释好的二抗（山羊抗兔/鼠HRP），37 ℃孵育30 min。PBS清洗3次后，DAB避光显色，镜下观察直到棕褐色阳性结果出现。水洗、苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。荧光显微镜进行观察，使用Image J软件计算每个视野下阳性结果的积分吸光度和面积。

2.5.3 肾组织IL-1β、IL-6、IL-17、VEGFA、MAPK、TNF-α水平取肾组织，使用10倍体积PBS冰上研磨，研磨后4 ℃静置2 h，然后3 000 r/min离心20 min，取上清液。按照试剂盒说明书操作，样本孔按10∶1比例加上清液，后再以40∶1比例加稀释液，再分别加入IL-1β、IL-6、IL-17、VEGFA、MAPK、TNF-α抗体；空白对照孔不加任何试剂；酶标仪上450 nm处，用空白对照孔为标准，测各孔光密度值。每个样本各5孔，每次实验重复3次。

2.6 统计学方法 使用IBM SPSS Statistics 26.0进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnett’sT3检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠空腹血糖水平比较 与对照组比较，模型组及芪黄药对组大鼠空腹血糖水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，芪黄药对组大鼠空腹血糖水平在第14天、第21天明显降低（P＜0.05）；第28天空腹血糖水平有所下降，但与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见图1）

图1 各组大鼠空腹血糖水平比较（，n=10）

3.2 各组大鼠24 h尿蛋白、肾功能比较 与对照组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白、肌酐水平、尿素氮水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，芪黄药对组大鼠24 h尿蛋白、肌酐水平、尿素氮水平均明显降低（P＜0.05）。（见图2）

图2 各组大鼠24 h 尿蛋白、肾功能比较（，n=10）

3.3 芪黄药对对糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化的影响 对照组大鼠肾组织α-SMA表达不明显；模型组大鼠α-SMA在肾间质中明显表达，见大量深棕黄色物质；芪黄药对组大鼠肾间质的α-SMA表达明显减少。（见图3）

图3 各组大鼠肾组织α-SMA 表达情况（免疫组化）

与对照组比较，模型组大鼠α-SMA表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，芪黄药对组大鼠α-SMA表达明显降低（P＜0.05）。（见图4）

图4 各组大鼠肾组织α-SMA 表达情况比较（，n=10）

3.4 芪黄药对靶标及肾间质纤维化靶基因筛选与交集 从TCMSP数据库中筛选黄芪及大黄相关有效化合物和作用靶点。逐一对应有效成分和靶点的对应关系，删除重复靶点，并使用Uniprot数据库转换成Gene Symbol后，共得到芪黄药对的有效化合物24个，对应靶点102个。以“Diabetic Nephropathy”为关键词，分别从GeneCards、OMIM、TTD数据库获得2 974、251、19个靶点，筛查重复值后得到3 149个靶点；以“Renal tubular fibrosis”为关键词，分别从GeneCards、OMIM、TTD数据库获得3 344、207、0个靶点，筛查重复靶点后得到3 511个靶点，两者分别汇总再取交集，共得到4 976个DN肾间质纤维化相关靶点。两者交集获得芪黄药对改善DN肾间质纤维化的可能作用靶点55个，对应有效化合物22个，其中大黄7个，黄芪15个，利用Cytoscape软件构建芪黄药对改善DN肾间质纤维化的“有效成分-作用靶点”相互作用网络，见图5。其中，各化合物连接度的平均值为7.8，中位数为4。度值最高的为槲皮素（quercetin)，其余依次为山柰酚（kaempferol）、异鼠李亭（isorhamnetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、芦荟大黄素（aloe-emodin）和芒柄花黄素（formononetin）等，度值排名前10的化合物信息见表1。这些度值较高的化合物可能是芪黄药对改善DN肾间质纤维化的关键化合物。

表1 芪黄药对改善DN 的关键化合物

图5 芪黄药对治疗DN 肾间质纤维化的“有效化合物-作用靶点”网络

3.5 PPI网络及关键靶点 将上述获得的芪黄药对改善DN肾间质纤维化的55个作用靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析，然后使用Cytosacpe软件对其进行优化，得到最终的芪黄药对改善DN肾间质纤维化的PPI网络图，见图6。拓扑分析结果显示，网络中各节点的连接度中位数为19.3，节点介度中位数为1.31×10-2，节点紧密度中位数为0.602，其中连接度、介度、紧密度均超过中位数的靶点有14个（见表2），推测这些靶点可能是芪黄药对改善DN肾间质纤维化的关键靶点。

表2 芪黄药对改善DN 肾间质纤维化的关键靶点

图6 芪黄药对改善DN 肾间质纤维化作用靶点的PPI 图

3.6 关键靶点的功能和通路分析结果 根据GO和KEGG分析结果确定芪黄药对改善DN肾间质纤维化功能及作用机制，以分析芪黄药对改善DN肾间质纤维化的可能途径。GO分析获得209个生物学功能，其中60条有显著意义（P＜0.01），KEGG分析获得88条通路，其中65条有显著意义（P＜0.01）。根据P由低到高，分别选取排名前20者，绘制芪黄药对改善DN肾间质纤维化作用靶标的GO功能分析和KEGG通路富集分析结果的气泡图，见图7～8。其中排序越靠前，提示越可能是芪黄药对改善DN肾间质纤维化的主要生物学功能和作用机制。

芪黄药对改善DN肾间质纤维化作用靶标的GO功能分析主要富集在炎症反应、凋亡信号通路、细胞对活性氧的反应、血管内皮细胞迁移的调节、胶质细胞凋亡过程、平滑肌细胞迁移、巨噬细胞分化、成纤维细胞增殖的调控和正调控胰岛素样生长因子受体信号通路等生物学功能。（见图7）

图7 芪黄药对改善DN 肾间质纤维化作用靶点的GO 功能分析结果

芪黄药对改善DN肾间质纤维化作用靶标的KEGG通路富集分析主要富集在炎症反应，液体剪切应力和动脉粥样硬化，肿瘤坏死因子信号通路，细胞凋亡，松弛素信号通路，HIF-1信号通路，MAPK信号通路，IL-17信号通路，NF-κB信号通路，p53信号通路和VEGF信号通路等相关通路。（见图8）

图8 芪黄药对改善DN 肾间质纤维化作用靶点的KEGG 通路富集分析结果

3.7 ELISA验证芪黄药对对预测靶标的影响 对预测的IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8靶标及炎症因子IL-1β、IL-17进行ELISA验证。与对照组比较，模型组大鼠肾组织中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，芪黄药对组大鼠肾组织中VEGFA、MAPK8、IL-1β、IL-6、IL-17水平均明显降低（P＜0.05），而CASP3水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图9）

图9 各组大鼠肾组织中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17 水平比较（，n=10）

4 讨 论

糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，临床上可引起各系统重要脏器的严重并发症，而DN是其最常见且最严重的慢性并发症之一。在西方国家，DN是终末期肾病的最主要病因，有将近40%的慢性肾衰由DN引起；而在我国，DN则是高达13.5%患者接受血液透析治疗的原因[8]，此外它的发病率还在不断增加[9]。因此如何有效预防DN发生并减慢其发展进度，是目前内分泌医学研究者关注的热门课题。然而尽管对DN发病机制的研究深度不断增加，但有关DN临床治疗的研究进展仍停滞不前。现代医学主要是通过血压控制、糖脂代谢控制及低蛋白饮食方案等对症治疗DN。近年来单纯或联合使用ACEI、ARB以减轻蛋白尿减少肾脏损伤亦取得一定临床疗效[10]，但仍有很大局限性。至今还未发现可以阻断DN进展的药物，病情发展至肾功能衰竭阶段时，只能采取肾脏替代治疗维持生命。因此，寻找能改善DN的有效且安全的药物具有重要意义。

现代医学认为DN的发展过程包括肾小球高滤过、蛋白尿进展，然后是肾小球滤过率下降，最终发展为终末期肾病，其对应的病理表现包括肾小球肥厚、肾小球硬化、肾间质炎症和纤维化[11]。既往大多数学者认为DN是一种肾小球疾病，而肾间质炎症和纤维化通常被认为是DN后期阶段才会发生的病理改变。因此，以往对DN发病机制的研究大多围绕肾小球进行，而对体积占到整个肾脏体积90%的肾间质的研究[12]则较少。但近年来的许多研究表明，即便是在DN早期，肾间质病变也可独立并早于肾小球损伤发生。有研究[13-14]分析了2型糖尿病的DN患者早期阶段的肾脏结构，结果显示仅有30%患者表现为典型的糖尿病肾小球病变，而40%的患者患有更严重的肾间质和（或）血管病变。并且，肾间质病变不仅可能比肾小球损伤提前发生，其病变程度甚至可能决定了DN患者肾脏功能损伤的程度[15]。因此，肾间质纤维化是DN重要的病理改变，延缓乃至逆转肾间质纤维化对改善DN预后至关重要。

中医学没有关于DN的病名记载及相关专著，但根据其临床表现，DN属中医学“肾消”“虚劳”“水肿”“关格”等范畴。早在东汉张仲景的《金匮要略》就有相关论述：“小便不利者，有水气，其人若渴，用栝蒌瞿麦丸主之”。又如《圣济总录》中所言：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开合不利，水液聚于体内而出现水种”，认为DN是肾气虚衰，气化失常开阖不利所致。而现代中医对DN的辨证论治已基本趋于统一，认为其证候本质为本虚标实，即以虚为本，浊瘀为标[3-4]。一方面，DN患者多有气虚的证候特点，病位多在脾肾。脾虚则无力运化水液，水液停聚成痰浊湿邪，阻碍气机升降而出现呕吐，湿邪外犯肌肤而出现浮肿、皮肤瘙痒；肾气不足，膀胱气化不利则有癃闭、蛋白尿等表现，DN患者多有倦怠乏力、气短懒言、腰膝酸软等脾肾虚衰的表现。另一方面，痰浊瘀阻血脉则出现高血压，瘀阻心脉则出现心悸。浊瘀积久，因实致虚，耗损精血，形成恶性循环。这也和中医“久病入络”“久病必虚”“水停则血瘀，血瘀则水停”等的理论不谋而合。总体而言，DN早期患者多缺乏特异性症状，中期患者普遍出现乏力、腰酸、浮肿等症状，晚期患者症状错综复杂。现代中医药临床研究学者开展了大量关于DN的中医临床研究[16-19]，结果显示，中医药不仅可以改善DN患者的临床症状，还能减少尿蛋白排泄、改善肾功能，并且能提高DN患者的生存质量。

而在中医学使用益气降浊法治疗DN的药物中，芪黄药对，即黄芪、大黄是使用频率最高且最具代表性的中药[6]。黄芪具有补气固表、利水消肿、托毒排脓等功效，大黄具有泻热通腑、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄等功效，两者一补一泻，与糖尿病肾病以虚为本、以浊瘀为标的病机对应。近年来多项体内外实验研究证明，黄芪、大黄对DN肾间质纤维化有显著的保护作用。如黄芪多糖为中药黄芪的有效成分之一，具有抗应激、抗氧化和免疫调节等多种药理作用。黄芪多糖可以负性调控肾间质上皮细胞转分化，减轻肾间质纤维化[20]；下调NF-κB、MCP-1表达，从而降低24 h尿蛋白、NAG，保护肾间质[21]；下调TGF-β1的表达，保护足细胞，减轻肾脏肥大[22]。氧化应激（oxidative stress）学说是目前最重要的DN发病机制相关学说之一[23]，肾间质细胞氧化应激损伤在DN的发生发展中有非常重要的地位[24]，而黄芪多糖具有抗氧化应激的作用[25]。大黄酸（Rhein）属于大黄蒽醌衍生物中的一种，可以通过抑制TGF-β诱导的肾小球系膜细胞增生、肾脏固有细胞肥大及细胞外基质堆积，抑制葡萄糖转运蛋白1表达，抑制成纤维细胞增殖并促进其凋亡[26-27]，大黄制剂可通过AKI信号通路抑制氧化应激等[28]达到对DN肾间质纤维化的保护作用。

本研究采用链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠模型观察了芪黄药对对糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化及炎症因子的影响。结果显示，芪黄药对能有效降低糖尿病肾病模型大鼠的24 h尿蛋白、肌酐和尿素氮水平。但芪黄药对对大鼠空腹血糖影响不明显，这表明芪黄药对改善糖尿病肾病大鼠肾功能的机制并非直接控制血糖。α-SMA是肌成纤维母细胞的标记分子，α-SMA表达增加是肾间质纤维化的重要标志[29]。免疫组化结果表明，α-SMA在模型组大鼠肾间质中显著表达，芪黄药对能有效降低糖尿病肾病模型大鼠肾间质的α-SMA表达。本实验证明芪黄药对可以减轻糖尿病肾间质纤维化。

以往对芪黄药对改善DN肾间质纤维化的研究多专注于单药或某化合物的改善机制，而缺乏整体性、系统性。本研究通过网络药理学虚拟模拟的方法，系统地探讨了芪黄药对改善DN改善肾间质纤维化的作用机制。结果显示，芪黄药对可以通过槲皮素、山柰酚、异鼠李亭、芦荟大黄素、芒柄花黄素等有效成分，作用于IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、ERBB2、PPARG、NOS3等靶点，通过影响TNF、松弛素、HIF-1、MAPK、IL-17、NF-κB、p53、VEGF等信号通路，发挥改善DN肾间质的血流动力学状态、糖脂代谢、细胞凋亡、氧化应激等生物学过程的作用，进而改善DN肾间质纤维化。因此，本研究进一步采用ELISA检测肾脏组织中预测关联度最高的靶标IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8，以及炎症因子IL-1β、IL-17水平。结果表明，模型组大鼠肾组织中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17水平表达显著增高，而芪黄药对可以明显降低大鼠肾组织中VEGFA、MAPK8、IL-1β、IL-6、IL-17的水平。研究表明，VEGF通路参与了肾间质纤维化的病理改变过程，其相关机制是调节血管新生、调节血管内皮通透性、诱导内皮细胞增殖等。VEGFA可促进周细胞向肌成纤维细胞转分化，使细胞外基质持续累积，进而加重肾纤维化[30]。MAPK通路的活化可激活下游TGF-β1基因的过度转录和翻译，加剧ECM的沉积和炎症反应[31]。IL-1β、IL-6、IL-17与糖尿病肾病肾损害进展有关[32-33]，其表达水平与糖尿病动物模型及糖尿患者的蛋白尿程度呈正相关，并可促进糖尿病肾病的肾间质纤维化[34]。表明芪黄药对可能通过VEGF通路及MAPK通路改善糖尿病肾病炎症反应、清除炎症因子而达到改善肾间质纤维化的作用。

综上，芪黄药对作用机制轴可能是“多成分-靶点（VEGFA、MAPK）-表型（炎症反应）-功能（肾间质纤维化）”。芪黄药对具有保护肾功能、改善肾间质纤维化、清除炎症因子的作用。