高效液相色谱法测定透析液中枸橼酸根含量

2021-11-24曲亚南徐苏华叶晓燕黄麒谕柯军通信作者

医疗装备 2021年20期

曲亚南，徐苏华，叶晓燕，黄麒谕，柯军(通信作者)

1 国家药品监督管理局体外循环器械重点实验室·广州市生物医用血液净化材料研究与开发重点实验室 (广东广州 510663)；2 广东省医疗器械质量监督检验所包装材料容器检验中心 (广东广州 510663)；3 广东省医疗器械质量监督检验所 (广东广州 510663)

枸橼酸钠是一种抗凝血剂，被临床用于血液透析中。目前，枸橼酸抗凝在血液透析中有多种应用方案，其中一种是将枸橼酸加入透析液中进行体外循环抗凝[1]。检测该类透析液中枸橼酸根含量的方法主要参考《中华人民共和国药典》2020年版四部3108枸橼酸离子测定法第二法[离子交换高效液相色谱法(ion-exchange high performance liquid chromatography，IEC-HPLC)]与第三法[反相色谱柱盐洗脱法(reverse phaseyquid chromatography citrate in dialysa，RP-HPLC)][2]。其中，《中华人民共和国药典》2020年版四部3108枸橼酸离子测定法第三法中前处理(步骤为取供试品溶液1 ml，精密加1.5%磺基水杨酸4 ml，混匀，于室温下静置2 h以上，以3 000 r/min离心10 min，取上清液测定)的目的是除去血液制品中的蛋白质，需要较长时间及稀释样品。本研究根据透析液样品不含蛋白质的实际情况，对《中华人民共和国药典》2020年版四部3108枸橼酸离子测定法第三法前处理进行适当优化，即省略加入磺基水杨酸溶液与离心步骤，并进行方法验证和样品测定，同时按《中华人民共和国药典》2020年版四部3108枸橼酸离子测定法第三法平行测定透析液，验证两种测定结果的一致性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20A高效液相色谱仪；Sartorius SQP SECURA224-1CN电子天平；广东立佳实业有限公司LDZF-6020真空干燥箱；梅特勒-托利多S220 pH计；Brand移液器；上海飞鸽TDL-5-A低速台式离心机；二水合枸橼酸钠，SIGMA-ALDRICH，批号LRAC3037，使用前真空60 ℃干燥至恒重；无水磷酸氢二钠，广东光华科技股份有限公司，分析纯；无水磷酸二氢钠，广东光华科技股份有限公司，分析纯；异丙醇，天津市大茂化学试剂厂，分析纯；磷酸，广州化学试剂厂，分析纯；磺基水杨酸，天津市大茂化学试剂厂，分析纯。

1.2 测试样品

取枸橼酸根阴性透析液样品(A)一批及枸橼酸根阳性透析液样品(B)一批。

2 优化法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为InertSustain C18，4.6 mm×250 mm；进样量为20 μl；流动相为18.2 mmol/L磷酸盐缓冲液(含18.2 mmol/L无水磷酸二氢钠、18.2 mmol/L无水磷酸氢二钠混合溶液和0.1%异丙醇，用磷酸调节pH=2.00)；流速为1 ml/min；波长为210 nm；柱温箱为40 ℃。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的二水合枸橼酸钠对照品0.5011 g，用水溶解并定容10 ml。

2.3 供试品溶液的制备

取样品经0.2 μm滤膜过滤后直接注入高效液相色谱仪。

2.4 加标样品的制备

取阴性样品(A)及阳性样品(B)加入适量枸橼酸根标准溶液，得到以下加标样品(表1)。

表1 加标样品浓度(mg/ml)

2.5 方法学考察

2.5.1系统适用性

将对照品溶液用水稀释至0.3007 mg/ml，同时取阴性样品(A)及阳性样品(B)测定，结果发现，阴性对照溶液在与对照品溶液相同保留时间处无色谱峰(图1)；系统适用性参数见表2。

表2 系统适用性

2.5.2方法检出限和方法定量限

取11份检出限加标样品经0.2 μm滤膜过滤，检测待测物峰面积，求出标准偏差，根据公式(方法检出限=3×S×k/a，方法定量限=10×S×k/a，S为峰面积的标准偏差，k为稀释倍数，a为标准曲线斜率)求出方法检出限和方法定量限，见表3。

表3 方法检出限及方法定量限结果

2.5.3线性范围

精密量取储备液适量，用水稀释制成系列溶液，进样测定，以浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标绘制标准曲线(图2)，结果表明，枸橼酸根在浓度范围内的线性关系良好，相关系数R2为0.99998，见表4。

表4 线性关系(n=2)

2.5.4回收率及精密度试验

取阴性样品(A)及阳性样品(B)的加标样品1～3进行测定，计算得到回收率及精密度，见表5。

表5 回收率和精密度结果

2.6 样品测定与结果对比

取阳性样品(B)，分别按《中华人民共和国药典》2020年版四部3108枸橼酸离子测定法第三法及其优化法进行测定，结果显示，两种方法差异无统计学意义(t=1.587，P>0.05)，见表6。

表6 阳性样品(B)中枸橼酸根含量测定结果(mg/ml)

3 讨论

3.1 流动相的选择

由于枸橼酸在水溶液中很容易电离，产生多峰现象[3]，为了使其尽可能以分子形式存在，流动相pH极为重要。透析液样品pH一般为7.0～8.0，若直接进样与流动相混合，较易产生溶剂效应，《中华人民共和国药典》2020年版四部3108枸橼酸离子测定法第三法中规定流动相pH为2.0～2.5，本研究尝试pH 2.25和2.00，发现pH 2.25出现双峰现象，流动相pH 2.00时枸橼酸根色谱峰型对称，故选择流动相pH 2.00进行试验。