黑糌粑功效成分花青素及抗氧化性的分析

◎ 扎西穷达，曹叶伟，朱肖翔，次仁卓嘎，尼 珍

（西藏自治区食品药品检验研究院，西藏 拉萨 850000）

黑糌粑是用黑青稞炒熟后磨成粉状，是西藏传统特色食品，黑糌粑营养丰富，风味独特[1]。目前，对黑糌粑的分析研究主要集中在对其中基础营养成分的测定研究，而对关键功能特性和功能物质，特别是对一些颜色较深的黑糌粑中花青素总量等研究报道很少，本研究中选取与黑糌粑功能及作用相关的重要理化指标进行分析，为黑糌粑的品质分析提供参考依据。

黑糌粑作为藏区人们食用的重要主食之一，能为食用者提供能量，还能提供提高免疫力等作用的功能因子[2]，因此，针对黑糌粑具有降血脂、降血糖、抗氧化和抗癌等辅助功效，分别选取花青素含量、抗氧化性指标进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

拉萨堆龙古荣黑糌粑（7批）、山南隆子加玉黑糌粑（6批），共13批。

1.2 试剂

超纯水、Tris-HCl、邻苯三酚、磷酸缓冲液、过氧化氢、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、十二水合硫酸铁铵、盐酸、正丁醇、乙醇，除另有说明外，所有试剂均为分析纯；原花青素标准对照品（纯度＞98%）；甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯。

1.3 仪器

液相色谱仪，配有二极管阵列检测器；TU-1810D紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Scilogex MX-S涡旋混合器；电子天平，感量为0.000 1 g；离心机，转速可达8 000 r·min-1以上；超低温冰箱，（-80±5）℃；超声波清洗器，40 kHz；旋转蒸发仪，带有温度控制；控温磁力搅拌器，带有温度控制。

1.4 方法

1.4.1 样品中总花青素的含量

（1）溶液的配制。标准溶液：称取原花青素对照品1.5 mg，甲醇溶解稀释至5 mL，制成0.3 mg·mL-1原花青素标准溶液。2.0%硫酸铁铵溶液：精密称取硫酸铁铵0.20 g，加2 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释至10 mL，摇匀。5%盐酸/正丁醇溶液：于100 mL容量瓶中加入约2/3的正丁醇，精密加入盐酸5.0 mL，用正丁醇溶解至刻度。

（2）测定。①标准曲线的制作：分别精密吸取原花青素标准溶液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL和1.50 mL至10 mL比色管中，分别加甲醇2.90 mL、2.75 mL、2.50 mL、2.00 mL和1.50 mL，摇匀（定容到3 mL）。分别吸取上述溶液1 mL，加入6 mL的5%盐酸/正丁醇溶液、0.2 mL的2.0%硫酸铁铵溶液至具塞试管中，于沸水浴中加热40 min，冰浴冷却15 min；用1 mL甲醇、6 mL 5%盐酸/正丁醇溶液和0.2 mL的2.0%硫酸铁铵溶液做空白，于546 nm波长处测定吸光度值。②试样制备。称样品充分混匀后取2.0 g于15 mL离心管中，加10.0 mL甲醇，搅拌均匀后离心，取上清液0.5 mL用甲醇稀释至10 mL制成样品待测液。③试样中原花青素含量的测定。取样品待测液1.0 mL，加入6 mL的5%盐酸/正丁醇溶液、0.2 mL的2.0%硫酸铁铵溶液至具塞试管中，于沸水浴中加热40 min，冰浴冷却15 min，分别测定其吸光度值，以空白试剂调零，根据式（1）计算样品中原花青素的含量[3]。

式中：Xi-试样中被测组分含量，mg·g-1；Ci-被测组分浓度，mg·mL-1；V-定容体积，mL；f-稀释倍数；M-样品质量，g。

（3）仪器条件。紫外分光光度计，波长为546 nm。

1.4.2 矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量

（1）溶液的配制。单一组分标准溶液：准确称取标准品各5.0 mg，甲醇定容至10 mL，配制成500 mg·L-1标准储备液，-18 ℃以下贮存，备用。混合标准溶液：根据各种黄酮类物质在仪器上的响应值，逐一吸取一定单一体积标准溶液配制成混合标准溶液，再稀释成不同质量浓度的混合标准溶液，用于制作标准工作曲线，混合标准溶液现用现配。

（2）测定。称取2 g试样（精确到0.01 g）于50.0 mL棕色离心管中，加入约5 mL 80%乙醇溶液，混合，室温下超声30 min，3 500 r·min-1离心5 min，上清液转入10 mL棕色容量瓶中，残渣再用约5 mL 80%乙醇溶液按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，用80%乙醇溶液定容至10.0 mL，准确吸取10 mL提取液于50 mL旋转蒸发瓶中，35 ℃下减压蒸发除去乙醇，浓缩至约3 mL。C18固相萃取小柱依次用约5 mL甲醇和约5 mL水预淋洗、活化后，将样品提取浓缩液加至小柱中，旋转蒸发瓶用5 mL水清洗，清洗液转入小柱中，抽滤，弃除滤液。再用约8 mL甲醇分别清洗两次，清洗液加入到小柱中，收集滤液，甲醇定容至10.0 mL，过滤膜，待测定[4]。

（3）仪器条件。高效液相色谱法配二极管阵列；检测波长：520 nm；色谱柱：C18色谱柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，颗粒度5 μm；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL；流动相：流动相A：20%甲酸；流动相B：100%乙腈。洗脱梯度条件见表1。

表1 洗脱梯度表

1.4.3 水溶物抗氧化性

（1）样品处理。精确称取黑糌粑粉2.0 g于离心管中，加入20 mL超纯水，涡旋混匀，超声提取30 min，涡旋混匀，放入离心机中3 500 r·min-1离心10 min，得上层清液为样品溶液。

（2）超氧阴离子自由基测定。取4.5 mL 0.05 mol·L-1、pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液于试管中，置25 ℃水浴中预热20 min，按顺序加入0.1 mL样品，0.4 mL 2.5 mmol·L-1邻苯三酚，混匀后在25 ℃水浴中准确反应4 min，立即用8 mol·L-1的盐酸2滴中止反应，测定波长299 nm处的吸光值，记为A测定。以0.1 mL蒸馏水代替样品，按同样方法测定吸光度，记为A对照[5]，根据式（2）计算：

（3）羟自由基测定。按顺序分别在试管中加入1 mL 0.15 mol·L-1、pH 7.4的磷酸缓冲液，0.5 mL样品，1 mL 1.3%过氧化氢（新鲜配制），1 mL 0.95 mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠（新鲜配制），混合后在30 ℃水浴中反应30 min后，在波长550 nm处测吸收度，记为C测定。空白以0.5 mL蒸馏水代替样品，按同样方法测定吸光度，记为C对照[6]，根据式（3）计算：

（4）仪器条件。紫外分光光度计；波长：299 nm、550 nm。

2 结果与分析

2.1 总花青素含量结果与分析

2.1.1 总花青素含量结果

黑糌粑具有独特的黑紫色，这主要与其中含有花青素密切相关。花青素也是黑糌粑抗氧化、去除自由基功能的重要基础物质，分析黑糌粑中的花青素总量，对了解和评价黑糌粑功能特性具有重要的参考作用。对13批黑糌粑样品已原花青素计，总花青素含量结果见表2。

表2 黑糌粑总花青素含量表

2.1.2 总花青素含量分析

通过对黑糌粑样品中总花青素数据分析表明，总花青素含量为0.451～0.916 mg·g-1，大部分集中在0.5～0.7 mg·g-1，其中山南隆子加玉黑糌粑3总花青素含量最高，拉萨堆龙古荣黑糌粑6含量最低。按不同产地比较，山南隆子加玉黑糌粑的花青素含量普遍高于拉萨堆龙古荣黑糌粑（见图1），不同产地的黑糌粑中总原花青素含量相差较大，这可能与种植环境、青稞种类及土壤等有一定的影响。

图1 黑糌粑中总花青素含量图

2.2 矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量结果和分析

2.2.1 矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量结果

花青素，是自然界一类广泛存在于植物中的天然色素，已知花青素有20多种，食物中重要的有6种左右[7]。黑糌粑中花青素主要存在的形式为矢车菊素及其葡萄糖糖苷。对黑糌粑花青素种类矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量结果见表3。矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品及黑糌粑样品色谱图见图2。

图2 矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品及黑糌粑样品色谱图

表3 黑糌粑花青素种类及含量表

2.2.2 矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量分析

通过表3发现，矢车菊素含量为0.034 4～0.046 7 mg·g-1，含量最高的样品是山南隆子加玉黑糌粑3；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量在0.008 6～0.0166 mg·g-1，含量最高的样品还是山南隆子加玉黑糌粑3，这与总花青素含量最高结果一致，也表明黑糌粑花青素主要以矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷存在，与抗氧化能力等正相关。一些样品中矢车菊素与其糖苷含量较低，说明这些样品中游离形式的花青素含量低，可能与样品的产地和加工方法相关。

2.3 水溶物抗氧化性含量结果与分析

2.3.1 水溶物抗氧化性含量结果

黑糌粑中含有一定量的抗氧化物质。氧化反应和脂质过氧化反应积极参与人体正常的生理生化反应和免疫反应，保持机体内正常的氧化还原电势以及在人体的新陈代谢中起着重要作用。因此，研究和评价物质的抗氧化活性，有利于促进人体的健康和多种疾病的预防与调控。

羟基自由基和超氧阴离子自由基是人体中能够产生的重要自由基，对人体健康具有重要影响[8]，通过分析黑糌粑中水溶性物质对这些自由基的抑制和清除效果，对了解不同种类黑糌粑产品的功能特性具有重要的参考价值。选取两批拉萨堆龙古荣黑糌粑和两批山南隆子加玉黑糌粑进行测定，结果见表4。

表4 黑糌粑水溶物抗氧化性表（单位：%）

2.3.2 水溶物抗氧化性含量分析

通过对4批黑糌粑样品中水溶性物质抑制人体代谢中可产生的羟自由基和超氧阴离子自由基能力的数据分析，结果表明，黑糌粑对羟自由基抑制率达到56.36%～89.34%，其中山南隆子加玉黑糌粑3抑制羟自由基的能力最强，几种黑糌粑对羟自由基的抑制效果均比较明显；黑糌粑对超氧阴离子自由基的抑制率达到52.95%～55.45%，其中拉萨堆龙古荣黑糌粑1对超氧阴离子自由基的抑制能力最好，但所有样品对超氧阴离子的抑制率均低于0.15 mg·mL-1Vc标准品溶液。

3 结论

黑糌粑中含有水溶性花青素、其他多酚类物质、超氧化物歧化酶等抗氧化、去除自由基的活性物质。若自由基产生过多或清除过慢，积累浓度过高时，会造成机体损伤，加速机体衰老并诱发各种疾病，如癌症、糖尿病和动脉粥样硬化等。黑糌粑中这些活性物质能通过清除机体自由基的方式降低各种疾病的发生率。

黑糌粑中呈现特有的黑紫色物质，主要是含有花青素有密切关系，其中黑糌粑中花青素主要由矢车菊素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷形式存在，这些物质其主要作用抗氧化，有效的自由基清除率。通过黑糌粑功效成分及作用分析，花青素含量为0.451～0.916 mg·g-1，大部分集中在0.5～0.7 mg·g-1；其中花青素种类中矢车菊素含量为0.034 4～0.046 7 mg·g-1，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量在0.008 6～0.016 6 mg·g-1；黑糌粑对羟自由基抑制率达到56.36%～89.34%，对超氧阴离子自由基的抑制率达到52.95%～55.45%。

通过对黑糌粑一些关键特征指标进行分析检测，结果表明，山南隆子加玉黑糌粑3含量高于其他样品，且这些指标含量分布有一定的高低，这可能与原料生产产地环境、加工条件都有一定关系，也对不同产地样品之间功能特性和作用等状况进行了解、评价；为黑糌粑产品的品质、功能特性的分析、监测等提供重要的思路和参考方法。