脾虚湿盛肝郁证溃疡性结肠炎大鼠模型的建立与评价*

李艺垚，马少丹，苑述刚

（福建中医药大学，福建 福州 350122）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是临床常见疑难病，其发病期和缓解期交替发作，主要表现为腹痛腹泻、黏液脓血便，或伴有腹胀、乏力、发热等[1]。根据其临床症状分析，该病应属中医“泄泻”“痢疾”“腹痛”等范畴。本课题组主要致力于研究久泻宁颗粒对溃疡性结肠炎的治疗作用及机理研究，久泻宁颗粒是原福建中医学院院长、全国著名中医药专家俞长荣教授治疗慢性泄泻的经验方，由参苓白术散与痛泻要方加减化裁而来，以健脾渗湿、调气止泻为法，临床治疗脾虚湿盛肝郁证UC疗效确切。建立合适的动物模型是研究疾病规律与药物疗效的基础，目前常见的UC中医证候模型有肝郁脾虚证[2]、脾虚湿困证[3]、湿热蕴结证[4]等。在前期相关研究中，课题组常采用三硝基苯磺酸（TNBS）-乙醇法或免疫复合物联合法制备UC大鼠模型，虽可体现UC的病理特点，但未考虑中医证候特点，且存在模型不稳定易自愈或造模周期长等缺陷。故本实验欲采用DSS溶液定量灌胃反复诱导的同时结合饮食、环境等因素干预希望建立与本课题研究对象相似的脾虚湿盛肝郁证UC模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物7周龄SPF级SD大鼠45只，雌雄各半，体质量（170±20）g，由浙江省实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（浙）2014-0001。实验动物在福建中医药大学动物实验中心饲养和管理，环境设施合格证号：SYXZ（闽）2014-0005。所有实验研究均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则，通过福建中医药大学伦理委员会审定，实验伦理批号：[2019]福中医伦理审字第（022）号。

1.2 药物与试剂葡聚糖硫酸钠（DSS，大连美仑生物技术有限公司，批号：S0808A）；猪油（天津聚龙粮油有限公司，批号：20180912C）；0.9%氯化钠注射液（江西科伦药业有限公司，批号：B18120702）；IL-2试剂盒（批号：201909）、TNF-α试剂盒（批号：201903）（江苏酶免实验有限公司）。

1.3 主要仪器电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；Thermo Fisher Heraeus Multifuge X1R台式离心机（Thermo Electron LED GmbH）；Multiskan FC型酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；ZT-14S1型生物组织自动脱水机（亚光医用电子技术有限公司）；YJ-BMC型生物组织石蜡包埋机（湖北锦源医用电子技术有限公司）；Leica RM2235型轮转切片机（德国Leica公司）；YT-7FB型摊烤片机（孝感亚光医用电子技术有限公司）；DM4000B型研究级生物显微镜（德国Leica公司）。

1.4 造模与分组45只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（n=10）、葡聚糖硫酸钠（DSS）组（n=10）、病证结合组（n=10）、模型组（n=15）。参照相关文献方法[5-7]并加以改进，制备UC大鼠模型：正常对照组予正常饲养，每日予生理盐水灌胃2次，2 mL/次，连续19 d。DSS组大鼠每日灌胃10%DSS溶液20 mL/kg，2次/d，连续7 d，建立急性溃疡性结肠炎模型，予正常饲养5 d，第13天再次灌胃10%DSS溶液20 mL/kg，2次/d，连续7 d，诱导复发。病证结合组大鼠予单日禁食，并4℃冰水灌胃，1次/d，2mL/次；双日正常饮食，并予猪油灌胃1次，2 mL/次，每日用纱布包裹长尾夹夹住大鼠尾部，30 min/次，使其暴怒，强迫大鼠站立在2 cm深的水中至少8 h，连续19 d。模型组大鼠采用DSS组结合病证结合组造模方法。造模完成后，正常对照组、DSS组、病证结合组、模型组各取10只大鼠第20天禁食不禁水24 h，取材进行病理观察。模型组剩余5只大鼠继续正常饲养14 d，取材进行病理观察。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况 造模期间观察各组大鼠一般情况，包括体质量、精神状态、动作行为、毛发光泽度、粪便性状等，并按UC疾病活动指数（DAI）评分标准[8]进行评分。（见表1）

表1 DAI评分标准

1.5.2 大鼠血清中IL-2及TNF-α含量 实验第21天，大鼠用20%乌拉坦（5 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，4℃，3 000 r/min，离心10 min，提取血浆上清液，-80℃保存待测。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定血清IL-2及TNF-α含量，严格按试剂盒说明书操作。

1.5.3 大鼠结肠组织病理学改变 从肛门向上截取大鼠结肠组织，沿结肠肠系膜缘纵向剪开，用生理盐水冲洗干净，平铺于滤纸上，肉眼观察结肠组织形态学改变，根据结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分标准[9]进行评分，见表2。取病变最明显处结肠组织，选取约1 cm×1 cm结肠组织，置于4%多聚甲醛固定后编号，酒精梯度脱水，二甲苯透化，常规石蜡包埋，切片厚度4 μm，苏木精-伊红染色（HE染色），中性树胶封片后，光镜下观察结肠病理变化。造模完成后第15天，上述方法取模型组剩余5只大鼠结肠组织，肉眼观察结肠组织形态学改变，固定、包埋、切片、染色后镜下观察结肠病理改变。

1.6 模型评定

1.6.1 脾虚湿盛肝郁证模型评定标准 根据参考文献[10-12]拟定，主症：（1）倦怠疲乏，懒动扎堆；（2）精神萎靡，毛色光泽度下降、晦暗枯槁、稀疏易脱落；（3）便软或溏，肛周污秽，排便时肛门红肿，甚至脱肛；（4）行动缓慢，甚至斜行。兼症：（1）体质量不增或增长缓慢，甚至降低；（2）饮食量减少；（3）胃肠明显胀气。以上症状出现3项主症或2项主症加上2项兼症即可认为脾虚湿盛肝郁证模型复制成功。

1.6.2 UC模型评定标准 根据参考文献[13-14]拟定，（1）DAI评分初步了解动物病症发展的严重程度；（2）肉眼观察结肠组织可见结肠充血水肿、肠壁增厚，严重者尚可见散落的溃疡点；（3）病理学观察一般表现为大量淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞等炎症细胞浸润，腺体呈现杯状细胞减少或消失，有隐窝脓肿和溃疡形成；（4）血清中白细胞介素-2（IL-2）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量变化。确定UC动物模型成立与否，主要取决于上述结肠组织病理学的改变。

1.7 统计学方法采用统计软件SPSS 23进行结果分析，计量资料以（±s）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用最小显著差数LSD法，重复测量计量资料采用重复测量方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况比较DSS组大鼠造模第20天死亡1只，其肛周有大量血性污秽，考虑DSS药物不耐受，不计入血清指标检测数据统计，其余大鼠均正常。正常对照组大鼠精神状态良好，反应灵活，饮食量正常，皮毛光泽顺滑，粪便呈椭圆状；模型组大鼠出现精神萎靡，蜷卧懒动，扎堆嗜睡，抓取时暴躁易怒，体质量明显下降，大便偏稀，呈月牙状，有白色偶可见血色脓性分泌物附着，肛周污秽等症状；DSS组大鼠出现精神不振懒动扎堆，大便软或溏，肛周污秽等症状，皮毛变化不明显。

2.2 各组大鼠体质量比较造模第1天，各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；第12、19天，模型组、病证结合组大鼠体质量均明显低于正常对照组（P＜0.01）。第7、12、19天，模型组、病证结合组大鼠体质量明显低于DSS组（P＜0.01或P＜0.05）。造模期间各组大鼠体质量的分组主效应（F=7.894）、时间主效应（F=25.526）和分组与时间的交互效应（F=30.392）均有统计学意义（P＜0.01）。（见表3、图1）

表3 各组大鼠造模后体质量比较（±s，g）

表3 各组大鼠造模后体质量比较（±s，g）

注：F时间主效应=25.526，P时间主效应=0.000；F分组主效应=7.984，P分组主效应=0.000；F交互效应=30.392，P交互效应=0.000；与正常对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与DSS组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别 动物数（只） 第1天 第7天 第12天 第19天 F P正常对照组 10 203.80±7.20 249.68±13.89 284.08±20.44 313.57±19.20 0.427 0.514 DSS组 10 204.00±7.40 235.82±11.69 272.98±12.64 246.00±15.49a 30.567 0.000病证结合组 10 200.70±5.49 193.99±6.55ad 201.58±11.47bd 203.48±12.55bc 35.752 0.000模型组 15 201.20±6.80 191.38±7.90ad 201.94±9.39bd 196.66±9.30bc 32.454 0.000 F 0.065 7.990 9.899 13.943 P 0.978 0.000 0.000 0.000

图1 体质量交互效应轮廓图

2.3 各组大鼠DAI评分比较第7、12、19天，模型组、DSS组、病证结合组DAI评分均明显高于正常对照组（P＜0.01）。第7、12、19天，模型组DAI评分明显高于DSS组（P＜0.01）。第7、19天，模型组DAI评分明显高于病证结合组（P＜0.01）。造模期间各组大鼠DAI评分的分组主效应（F=39.652）、时间主效应（F=97.117）和分组与时间的交互效应（F=17.343）均有统计学意义（P＜0.01）。（见表4、图2）

表4 各组大鼠DAI评分比较（±s，分）

表4 各组大鼠DAI评分比较（±s，分）

注：F时间主效应=97.117，P时间主效应=0.000；F分组主效应=39.652，P分组主效应=0.000；F交互效应=17.343，P交互效应=0.000；与正常对照组比较，aP＜0.01；与DSS组比较，bP＜0.01；与病证结合组比较，cP＜0.01

组别 动物数（只）第1天 第7天 第12天 第19天 F P正常对照组 10 0 0 0 0 - -DSS组 10 0 0.56±0.13a 0.57±0.10a 1.30±0.16a 12.168 0.000病证结合组 10 0 0.71±0.08a 0.75±0.07a 1.10±0.13a 27.746 0.000模型组 15 0 1.17±0.17abc 0.90±0.10ab 1.82±0.17abc 7.493 0.006 F 18.981 27.341 35.187 P 0.000 0.000 0.000

图2 DAI评分交互效应轮廓图

2.4 大鼠结肠黏膜病理改变比较正常对照组大鼠结肠纹理清晰，无损伤，组织结构完整，腺体排列整齐，间质未见水肿、充血、溃疡；DSS组大鼠结肠黏膜表面轻度充血、水肿，糜烂较局限，偶可见针尖样溃疡，腺体排列紊乱，部分结构破坏，杯状细胞消失，黏膜层局部破坏，溃疡边缘大量炎症细胞浸润，间质充血、水肿；病证结合组大鼠结肠纹理较清晰，黏膜表面偶可见充血，未见明显溃烂，腺体排列较整齐，结构基本完整，少量炎症细胞浸润，间质水肿；模型组结肠黏膜充血、水肿，糜烂不同程度加重，且溃疡点较多。模型组大鼠CMDI评分明显高于正常对照组（P＜0.01），黏膜层溃疡严重，腺体结构完全破坏，杯状细胞消失，大量炎症细胞浸润，间质水肿、充血明显且有炎症细胞浸润，提示造模成功。模型组CMDI评分明显高于DSS组和病证结合组（P＜0.01）。造模完成后第15天后取模型组大鼠结肠组织，肉眼观察结肠黏膜表面仍存在充血、水肿，可见针尖样散在溃疡点，黏膜层仍有缺损，腺体排列不规整，部分结构破坏，杯状细胞减少，大量炎症细胞浸润，间质水肿、充血，少量炎症细胞浸润。（见表5、图3）

图3 各组大鼠结肠组织病理形态改变（HE，×200）

表5 各组大鼠CMDI评分（±s，分）

表5 各组大鼠CMDI评分（±s，分）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与DSS组比较，bP＜0.01；与病证结合组比较，cP＜0.01

组别 动物数（只） CMDI评分正常对照组 10 0 DSS组 10 1.53±0.13a病证结合组 10 0.60±0.10a模型组 10 2.25±0.14a b c

2.5 各组大鼠血清IL-2及TNF-α含量比较模型组与DSS组大鼠血清IL-2水平明显低于正常对照组（P＜0.01），血清TNF-α浓度明显高于正常对照组（P＜0.01）；模型组大鼠血清IL-2水平明显低于病证结合组（P＜0.01），血清TNF-α水平明显高于病证结合组（P＜0.01）；模型组大鼠血清IL-2水平明显低于DSS组（P＜0.05）。（见表6）

表6 各组大鼠血清IL-2及TNF-α含量比较（±s，pg/mL）

表6 各组大鼠血清IL-2及TNF-α含量比较（±s，pg/mL）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与病证结合组比较，bP＜0.01；与DSS组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只） IL-2 TNF-α正常对照组 10 33.60±1.64 1.06±0.14 DSS组 9 25.39±0.56a 4.30±0.44a病证结合组 10 30.40±1.45 1.12±0.22模型组 10 23.24±0.55a b c 5.50±0.50a b

3 讨 论

中医学认为，泄泻发病的根本在于“脾虚”与“湿”，《素问·脏气法时论篇》曰：“脾病者，……虚则腹满肠鸣，飧泄食不化。”《素问·阴阳应象大论篇》曰：“湿胜则濡泻”，治疗以健脾利湿为原则。久泻宁颗粒治疗以脾虚湿盛肝郁为主的慢性泄泻，UC中医常见分型中并无脾虚湿盛肝郁证，这类患者多是由肝郁脾虚证泄泻发展而来，情志过极，肝失疏泄，克犯脾土，脾失健运而致泄泻，久而久之脾虚生湿，湿困脾土，更不能运化湿邪而加重泄泻，或是久居湿地或饮食不节，脾土本虚，肝木乘脾，致脾更虚，清浊不分，混杂而泻，时止时泻，迁延不愈，此时则会表现为以脾虚湿困为主兼有肝郁的泄泻，故久泻宁颗粒以健脾化湿为主，调气止泻为辅对这类患者进行治疗。此类患者常有UC病史，其病势呈急慢性交替发作，慢性缓解期时伴有便溏不爽，身倦体重，腹胀，食少纳差，脉弦等症状[15]，此时处于肝郁脾虚湿蕴的病理状态。

目前常用的UC造模方法有化学刺激法、免疫因素刺激法、复合法[16]，同时在此基础上进行饮食、环境等因素干预可复制出相应的UC中医证候模型。DSS作为常用诱导UC模型制剂，其使用方法简单，容易复制，且模型接近人类发病病因而被广泛采用。DSS常采用自由饮用的方法，一般在造模第3~4天可出现腹泻、脓血便等症状。但因动物个体差异，自由饮用会造成药物摄入量、摄入时间长短不一，使模型症状出现时间、症状表现程度、结肠损伤程度不均一，不利于后续给予药物后疗效的判断及新药治疗效果的研究。有研究[15]发现定量灌胃DSS溶液诱导的UC模型在溃疡出现的时间、程度、位置比自由饮用均一性显著提高。故本实验选择定量灌胃DSS方法诱导UC模型，控制诱导次数使模型产生急性与缓解期交替症状，复制UC发病周期规律。

实验结果显示单纯使用DSS诱导的UC模型，造模后出现便稀，结肠黏膜充血水肿，血清IL-2及TNF-α水平明显变化等符合UC病理特点，但饮食量、皮毛光泽度等一般情况未见明显变化，缺乏中医证候特点。单纯采用中医内外因干预方法造模诱导的模型，在体征上出现蜷卧懒动、不欲饮食、皮毛稀疏伴光泽度下降等中医证候特点，但血清IL-2、TNF-α含量水平及结肠病理变化不明显，与正常对照组比较，差异无统计学意义，考虑造模时间较短，尚未达到UC诊断标准。采用DSS定量灌胃反复诱导方法结合内外环境干预，在结肠溃疡性病变的同时使模型出现精神萎靡、倦怠懒动、嗜睡、不欲饮食、毛色枯槁变硬、毛发稀疏等脾虚湿盛肝郁证症状；结肠黏膜病理改变出现水肿、充血、糜烂，光镜下观察其改变符合UC诊断，最终形成脾虚湿盛肝郁证UC大鼠模型。造模后14 d模型大鼠仍有精神倦怠、懒动、不欲饮食等症状，镜下观察结肠组织仍存在水肿、充血及不同程度缺损，证明该方法制备的UC模型具有一定的稳定性。

本实验模型易复制、稳定性较好，并且符合UC病变机制和病程变化，避免免疫复合物模型制备过程繁琐、制备周期长等缺点，且无TNBS-乙醇模型或DSS模型的单纯细胞免疫反应、维持时间短等不足，定量灌胃还可规避因大鼠个体差异自由饮用DSS溶液导致模型结肠病变程度不同的缺陷，为较理想的UC中医证型动物模型。