痛风急性发作期的肠道菌群变化与中医证型的相关性*

刘明岭，何家颖，陈靖雯，邓日辉，徐 强，林昌松

（广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

痛风是一种表现为发作性关节红肿热痛的炎性疾病。肠道菌群与痛风有密切关系。GUO Z等[1]通过肠道菌群测序技术分析，发现痛风患者的肠道菌群整体结构与健康人群具有显著的差异，痛风患者肠道菌群中粪便拟杆菌（Bacteroides caccae）和木糖降解拟杆菌（Bacteroides xylanisolvens）致病菌丰度升高，而另2种益生菌普氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）和假小链双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）丰度降低。肠道菌群失调可导致尿酸晶体诱导产生NLRP3炎症小体相关的酶激活，最终导致痛风急性发作[2]。肠道菌群参与了嘌呤代谢酶的合成及炎症因子的释放[3]。ZAKHARZHE VSKAYA N B等[4]在动物模型中注射尿酸盐结晶后观察到了关节炎症的发生，而在无菌小鼠模型中注射尿酸盐结晶却未见关节炎症反应。肠道菌群在尿酸代谢、关节炎症反应中均具有关键作用。

目前中医研究认为，痛风急性发作最常见的病因病机是湿浊瘀热痹阻关节[5]。《中医内科病证诊断疗效标准》有关痛风的证候分为4个证型，即湿热蕴结、瘀热阻滞、痰浊阻滞、肝肾阴虚[6]。本研究根据临床痛风急性发作的常见证候，选择湿热蕴结与瘀热阻滞进行探讨。目前尚未见相关研究报道这2种证型客观的物质基础及其与肠道菌群的相关性。本研究采用宏基因组学技术研究肠道菌群与痛风急性发作的中医证型的相关性，旨在揭示痛风急性发作的关键菌群及不同中医证型的差异菌群，旨在为研究痛风急性发作的机制、中医证型的物质基础提供参考。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断 痛风急性发作诊断参照2015年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟痛风分类标准[7]，符合痛风诊断，符合1977年美国风湿病协会分类标准急性痛风关节炎的分类标准[8]。

1.1.2 中医诊断 湿热蕴结证与瘀热阻滞证辨证参照《中医内科病证诊断疗效标准》中痛风的诊断依据、证候分类、疗效评定[6]。（1）湿热蕴结证：下肢小关节卒然红肿热痛、拒按，触之局部灼热，得凉则舒，伴发热口渴，心烦不安，溲黄。舌红，苔黄腻，脉滑数。（2）瘀热阻滞证：关节红肿刺痛，局部肿胀变形，屈伸不利，肌肤色紫暗，按之稍硬，病灶周围或有块瘰硬结，肌肤干燥，皮色暗黧。舌质紫暗或有瘀斑，苔薄黄，脉细涩或沉弦。

1.2 纳入标准（1）符合痛风急性发作期诊断标准及中医证候标准；（2）年龄18～65岁，性别不限；（3）本次就诊为急性起病，病程在48 h内；（4）患者自愿接受并配合检查。

1.3 排除标准（1）近3个月内使用过抗生素、益生菌等；（2）合并急性感染及有严重心脑血管疾病及严重肝肾功能损害；（3）有精神疾患或依从性差的患者；（4）妊娠或哺乳期妇女。

1.4 研究对象 本研究选择2019年3月至2020年12月在本院风湿病科住院治疗的痛风急性发作期患者40例，湿热蕴结组与瘀热阻滞组各20例。同时纳入治未病中心健康体检人群20人为健康对照组。本研究经广州中医药大学第一附属医院伦理学委员会批准（NO.K[2019]096）。

1.5 观察指标

1.5.1 临床信息 参考《中医病证诊断疗效标准》[9]及《中药新药临床研究指导原则（试行）》[10]设计病例信息记录表，收集研究对象年龄、性别、体质量、身高、既往病史、痛风病史、症状、体征、中医舌脉及相关检验指标等信息。体质量指数（BMI）=体质量（kg）/身高（m）2。

1.5.2 样本采集与储存 收集受试者新鲜自然排出的粪便约2 g，置于2 mL无菌冻存管中，置于-80 ℃冰箱保存。4 ℃冷藏条件下送至武汉华大医学检验所有限公司进行测序和分析。

1.5.3 提取粪便DNA 采用MagPure Stool DNAKF kit B（Magen，中国）提取粪便中微生物群落DNA。质控采用BR Assay kit（Invitrogen，美国）对DNA进行荧光定量检测。

1.5.4 DNA扩增与测序 采用16sRNA基因的V4区对基因组进行扩增，PCR引物上下游分别为，515F（5'-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3'）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。前后端均采用Illumina接合器、pad和连接子序列标记引物。PCR扩增前，模板浓度统一稀释到0.6 ng/μL。PCR循环条件结果如下：95 ℃3 min，95 ℃30个循环45 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s，72 ℃持续10 min。PCR产物采用Agencourt AMPure XP beads纯化和缓冲液中洗脱。PCR扩增产物采用安捷伦科技2100生物分析仪进行质检，合格后进行文库构建。采用Illumina MiSeq测序平台进行250 bp×2双末端测序。下机后，要进行测序原始数据整理、过滤及质量评估；序列进行质控过滤后，接下来进行OTUs列表生成及注释。

1.6 数据处理 测序完成后，对原始数据进行处理，步骤如下：（1）去掉质量低、模糊的数据；（2）利用FLASH 软件（v1.2.11）对通过质量初筛的双端序列根据短序列快速长度调整进行配对连接，获得相应序列；（3）使用UPARSE软件（v7.0.1090）对获得的序列按97% cutoff值进行OUT归类划分，嵌合体序列使用UCHIME（v4.2.40）检测与Gold数据库进行比较；（4）根据最小置信度阈值为0.6，利用遗传算法对OTU代表序列进行分类，采用核糖体数据库项目（RDP）分类器v.2.2进行OTU分类，然后采用QIIME v1.8.0在Greengenes数据库v201305上进行分析；（5）使用USEARCH-global将所有序列与OTU进行比较，以获得各样品OTU丰度统计表；（6）根据OTU在每个样本中所包含的序列数，构建OTU在各样本中丰度的矩阵文件；（7）采用MOTHUR（v1.31.2）和QIIME软件（v1.8.0）对样品序列进行Alpha、Beta多样性分析；（8）采用QIIME软件（v1.8.0）进行样本聚类分析；（9）基于UPGMA、KEGG 和COG数据库，采用PICRUSt软件进行功能预测；（10）使用R软件，根据OTU丰度矩阵和样本分组数据构建PCoA分析，评估微生物群落的整体差异，根据OTU丰度矩阵表，使用R软件对丰度前50名的微生物属进行聚类分析并绘制heatmap聚类图。

2 结果

2.1 临床样本统计分析 本研究共纳入60名受试者，其中湿热蕴结组、瘀热组滞组与健康对照组各20人。入组人群的基本资料见表1。

表1 临床研究人群基本资料

2.2 肠道菌群16SrDNA测定结果 60份粪便样本总共获得7 562 932条有效序列，人均126 049条clean reads，测序平均覆盖度为98.16%。

2.3 肠道菌群物种注释 依据测序结果，对测出的序列进行注释，依照界、门、纲、目、科、属和种对肠道菌群进行了注释。测出的OTU总数为11 013个，对其进行注释后，得到门共计11个，纲共计19个，目共计27个，科共计52个，属共计138个，种共计226个。

图1展示了纲水平的注释结果，可进一步明确各个样本的菌群分布情况，出现的菌群按照门水平平均相对丰度（relative abundance，RA）由高到低前5名分别为：Bacteroidetes（平均RA 为44.21%），Firmicutes（平均RA 为42.25%），Proteobacteria（平均RA为8.14%），Fusobacteria（平均RA为2.52%），Verrucomicrobia（平均RA为1.45%）。在属水平，按照平均相对丰度由高到低前5名分别为：Bacteroides（平均RA为31.02%），Megamonas（平均RA为11.52%），Prevotella（平均RA为10.18%），Unclassified（平均RA为5.79%），Faecalibacterium（平均RA为4.46%）。

图1 3 组样本在纲水平的物种组成

2.4 肠道菌群的多样性比较分析 Alpha多样性指数（ACE、Chao1、Shannon、Simpson）显示瘀热阻滞组Alpha多样性指数高于健康人群，而湿热蕴结组的Alpha多样性指数低于健康人群。上述4种多样性指数值越高,表明群落的多样性越高。3组比较，湿热蕴结组略低于健康对照组，而瘀热阻滞组高于湿热蕴结组及健康对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图2）

图2 3 组间Alpha 多样性指数

Beta（β）多样性分析可以体现不同组之间的肠道菌群是否存在差异。β多样性分析显示：湿热蕴结组显著低于健康人群（R=0.052，P=0.007）；瘀热阻滞组高于健康人群，差异无统计学意义（R=0.027，P=0.32），湿热蕴结组低于瘀热蕴结组，但差异无统计学意义（R=0.035，P=0.108），3组间菌群比较，差异有统计学意义（R=0.051，P=0.025）。（见图3）

图3 3 组间Beta 多样性PCoA 分析

2.5 3组间菌群组成差异分析 菌属丰度排在前10的为Bacteroidia、Clostridia、Negativicutes、Gammaproteobacteria、Fusobacteriia、Verrucomicrobiae、Actinobacteria、Bacilli、Betaproteo bacteria、Erysipelotrichia。其中湿热蕴结组、瘀热阻滞组与健康对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）的菌群为Bacteroidia（相对丰度降低）、Negativicutes（相对丰度升高）、Actinobacteria（相对丰度升高）、Bacilli（相对丰度升高）。NMDS分析证实3组在肠道菌群属水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见图4）

图4 3 组间菌群组成差异分析

2.6 3组间菌群LEfSe分析 从LEfSe LDA图可以看出3组间的差异菌群，筛选出有显著差异Biomaker。图中显示瘀热阻滞组的多样性较丰富，代表性菌群较多，湿热蕴结组次之，健康对照组最少。（见图5）

图5 3 组间菌群LEfSe 分析

2.7 3组间属水平菌群结构差异热图分析 热图可显示各样本及组间的物种组成及丰度。与健康对照组比较，湿热蕴结组、瘀热阻滞组Bacteroidia、Fusobacteriia丰度降低，Clostridia、Negativicutes、Actinobacteria、Bacilli丰度升高。瘀热阻滞组菌属中Prevotella 菌群丰度上升，Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XlVb、Butyricimonas丰度降低；湿热蕴结组菌属中Bacteroides 菌群丰度上升，Paraprevotella、Dorea、Romboutsia丰度降低；健康对照组菌属中Bacteroidia菌群丰度上升，Lactobacillus、Faecalicoccus、Pseudoflavonifractor、Acidaminococcus、Clostridium_IV、Dialister丰度降低。（见图6）

图6 基于肠道菌群属水平差异物种的heatmap 聚类图

3 讨论

痛风是一种单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱及（或）尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，属代谢性风湿病范畴。我国痛风的患病率为1%～3%，逐年上升且呈年轻化趋势[11]。高嘌呤饮食会导致痛风发作，具体机制尚不清楚。人体存在数量巨大的肠道菌群，对人的生理、病理有重要影响[12]。这些影响包括关节促炎与抗炎反应,与关节炎的发生、发展有关[13]。中医学认为，痛风急性发作最常见的病因病机是湿浊瘀热痹阻关节[14]。《中医内科病证诊断疗效标准》有关痛风的证候分类将痛风发作期的证型分为湿热蕴结证与瘀热阻滞证等证型[6]。这2种证型客观的物质基础，以及其与肠道菌群的关联尚不明确。因此，本研究拟探讨痛风急性发作期的肠道菌群变化及其与中医证型的相关性。

本研究纳入人群主要为中老年男性，男性占85%以上，符合痛风发病的优势人群。痛风患者体质量均存在超重现象，明显高于健康人群，且50%以上合并高血压，较多合并糖尿病、高脂血症、肾结石及肾功能不全，与国内有关痛风流行病学报道基本一致[15]。

本研究通过16SrDNA测序发现，痛风患者的肠道菌群与健康人群存在显著差异，湿热蕴结证与瘀热阻滞证的痛风患者肠道菌群也存在差异。痛风急性发作期，主要表现为Bacteroidia丰度降低，Negativicutes、Actinobacteria、Bacilli丰度升高。而在不同证型之间，瘀热阻滞组菌属中Prevotella菌群丰度上升，Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XlVb、Butyric imonas丰度降低；湿热蕴结组菌属中Bacteroides菌群丰度上升，Paraprevotella、Dorea、Romboutsia丰度降低。这些升高的菌群绝大多数为致病菌，与炎症、免疫密切相关，而降低的为益生菌，与抗炎作用有关[16-18]。因此，可以从肠道菌群的角度阐释痛风出现急性炎症的部分机制。

中医辨证是中医四诊资料的高度概括，包括症状、体征、舌脉，这些变化与患者体质密切相关。本研究根据中医辨证进行分组，研究不同证型之间的肠道菌群差异，以寻找这些证型客观的物质基础。肠道菌群的变化与人的体质有密切关系[19-20]，这或许可以解释痛风急性发作期不同证型的菌群差异。目前有学者进行了中医证型与肠道菌群的相关研究，但未见痛风的中医证型与肠道菌群关系的相关研究报道。如周梦玲等[21]发现帕金森病内热证拟杆菌门丰度升高，厚壁菌门丰度降低；安明伟等[22]研究表明慢性腹泻脾胃湿热证患者肠道需氧菌（肠杆菌、肠球菌）丰度升高；张宁等[23]研究发现寒凝血瘀证模型组大鼠中Firmicutes显著上调，Bacteroidetes显著下调。这些研究与本研究相似，均证实了肠道菌群变化与中医证型的相关性。

本研究从肠道菌群的角度阐释了痛风急性发作期不同证型与肠道菌群失调的关系，并为不同证型找到了可能的标志菌属，为中医辨证论治提供了客观物质基础，也可能为痛风急性发作的机制提供了研究线索。但本研究属于探索性研究，发现的菌群尚需进一步验证，如采用菌群移植法进一步验证。因为本研究纳入的均为住院患者，病例数偏少，两种中医证型在年龄、BMI、病程上存在差异，所以在病例选择方面可能存在偏倚。因此，有必要扩大病例来源，增加样本量，使得各组在基线水平保持一致。