不同肩袖肌腱损伤动物模型建立与评价

于承浩,王磊,彭海宁,张益,于腾波

(青岛大学附属医院运动医学科,山东青岛 266100)

肩袖撕裂是肩袖及其邻近软组织损伤的总称,可以导致肩的疼痛和功能障碍。肩袖由冈上肌、冈下肌、肩胛下肌和小圆肌的肌腱以及肩关节囊等组成,对限制肩关节的过度活动和维持功能稳定性具有重要作用。肩袖撕裂在肌肉骨骼系统疾病中占有很大的比例。在美国每年超过25万人因为肩袖损伤接受了手术治疗,并且肩袖损伤的发生率逐年增加[1-2]。肩袖撕裂的类型往往不同,根据Ellman分型可将肩袖撕裂分为新月型撕裂、L型撕裂、反L型撕裂、梯形撕裂和巨大型撕裂[3]。不同的撕裂类型可导致不同的临床表现。

目前,有多种动物可以被用作比较与评价不同类型肩袖损伤愈合状况的模型动物,例如大鼠[4]、兔[5-6]、狗[7-8]、小牛[9]和绵羊[10-12]等。研究表明,虽然大鼠冈上肌在向前运动过程中会穿过纤维骨隧道,但是,穿过该隧道的是肌肉而不是肌腱[13]。此外,大鼠的冈上肌太小,造模困难。兔体型居中,价格低廉,易于饲养,目前兔肩袖已有多处肌腱用于肩袖损伤模型的建立,包括冈上肌[14-15]、冈下肌[16]以及肩胛下肌[17]。其中兔肩胛下肌肌腱与人冈上肌肌腱的位置与解剖结构相似,大小尚可,适合制备肩袖损伤模型进行研究[18]。故本研究以兔为模型动物,建立肩胛下肌的部分损伤、L型损伤和新月型损伤模型,通过生物力学与组织学评价,分析不同撕裂类型对肩袖损伤自然愈合的影响,以探寻适合今后实验的肩袖损伤模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用18只体质量2.0～3.0 kg的成年雄性新西兰大白兔由青岛大学动物实验中心提供;美国Instron-3300万能材料试验机由青岛大学提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立 将18只大白兔随机分为部分组、L型组和新月组,每组6只。以大白兔左侧肩胛下肌为实验侧,右侧肩胛下肌为对照侧。应用100 g/L水合氯醛(2.5 m L/kg)行腹腔注射麻醉,待兔角膜反射及夹捏反应消失后,将兔固定于手术台上,进行备皮、碘附消毒,铺无菌洞巾。于肩关节部位注射20 g/L 利多卡因2 m L 进行局部麻醉。于肩关节外侧做一长约3 cm 纵形切口,分离三角肌及冈上肌,显露肩胛下肌。测量兔肩胛下肌肌腱在肱骨小结节止点宽度;部分组将肩胛下肌肌腱于小结节连接处滑囊侧切断约50%;L 型组将肩胛下肌肌腱于小结节连接处一侧切断约50%;新月组将肩胛下肌肌腱于小结节连接处中间部分切断约50%(图1)。逐层缝合,关闭切口,覆盖纱布。对照侧进行假手术,显露肩胛下肌肌腱后关闭切口。术后给予青霉素4×105U 后肢肌注预防感染,持续3 d;允许兔笼内自由活动,未见活动障碍。

图1 兔肩胛下肌肌腱损伤模型的建立

1.2.2 组织学观察 术后4个月,从3组中各取1只兔,以左侧肩胛下肌损伤处为中心,截取肩胛下肌肌腱损伤处组织,用于观察肌腱愈合情况。标本经冷冻、包埋后切成6μm 厚的连续切片。分别进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色,在光镜下观察肩胛下肌肌腱损伤后愈合的组织学变化。

1.2.3 生物力学测试 术后4个月,从3组中各取5只兔,以肩胛下肌止点为中心,截取整块肩胛下肌及近端肱骨(双侧全部截取),处理肩胛下肌肌肉,留肌腱与近端肱骨,进行生物力学测试。肌腱侧采用“三明治”(砂纸-万能胶-肌腱-万能胶-砂纸)方法固定,近端肱骨采用麻绳固定。调整合适后,在美国Instron-3300万能材料试验机上进行拉力测试,载荷率为0.4 mm/s,详细观察记录肩胛下肌肌腱被拉断时的断裂部位、最大载荷(N)及杨氏模量(MPa)。为消除个体间的差异,以肩胛下肌实验侧/对照侧最大载荷及实验侧/对照侧杨氏模量的百分比作为生物力学强度指标。

1.3 统计学方法

用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计处理。计量数据以±s表示,多组整体比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用最小显著差异t检验(LSD 法)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 组织学观察

2.1.1 大体观察 肌腱损伤处可清晰辨认,部分可见结节形成,肌肉周围出现脂肪浸润,未见明显肌肉萎缩(图2a～c)。

2.1.2 染色观察 部分组实验侧HE 染色可见损伤处被致密结缔组织填充,与周围正常肌腱组织分界清晰;Masson染色可见损伤处结缔组织排列紊乱,胶原含量较正常肌腱组织少(图2d、g)。新月组实验侧HE染色可见损伤处组织较正常肌腱组织疏松,走行不规则;Masson染色可见损伤处胶原含量与周围正常组织接近,但组织更为疏松(图2e、h)。L型组实验侧HE 染色可见致密结缔组织堆积,与周围正常组织分界清晰;Masson染色可见损伤处结缔组织排列不规则,胶原含量较周围正常肌腱组织少(图2f、i)。

2.2 生物力学测试

在生物力学拉伸测试中,3组标本在承受最大负荷时的撕裂部位均为手术损伤处。3组肩胛下肌实验侧/对照侧最大载荷及实验侧/对照侧杨氏模量的百分比相比较,差异均具有显著性(F=36.292、18.876,P＜0.05)。组间两两比较,部分组和L 型组肩胛下肌实验侧/对照侧最大载荷百分比均显著低于新月组(t=8.023、6.494,P＜0.05),而部分组与L 型组比较差异无统计学意义(t=1.529,P＞0.05);同样,部分组和L型组肩胛下肌的实验侧/对照侧最大杨氏模量百分比均显著低于新月组(t=5.781、4.963,P＜0.05),而部分组与L 型组比较差异无统计学意义(t=1.088,P＞0.05)。见表1。

表1 各组实验侧/对照侧最大载荷及杨氏模量百分比比较(n=5,χ/%,±s)

表1 各组实验侧/对照侧最大载荷及杨氏模量百分比比较(n=5,χ/%,±s)

注:3组整体比较,F=36.292、18.876,P＜0.05。

组别最大载荷百分比杨氏模量百分比部分组76±2 51±4新月组91±2 70±7 L型组79±4 54±3

3 讨 论

兔肩胛下肌已被证明具有与人类冈上肌相似的解剖学和生物力学特性[19]。同时,兔的体型中等,价格低廉,饲养方便,具有进行动物实验的天然优势。不同的是,人肩关节的解剖结构复杂和活动范围大,肩袖肌腱的血运少,因此人的肩袖撕裂一般很难愈合[20]。本研究以兔为模型动物,建立了兔肩胛下肌肌腱损伤的3种动物模型(部分、新月、L 型),并使其自然愈合,探讨不同的损伤类型对肩袖损伤自然愈合的影响。

肌腱细胞外基质主要由Ⅰ型胶原和糖蛋白组成。Ⅰ型胶原约占所有胶原蛋白的95%,占肌腱干质量的65%～80%[21]。其他类型胶原蛋白的含量虽然较低,但也起着重要作用。肌腱损伤后,损伤部位发生炎症反应,巨噬细胞可清除并稀释有害物质,防止损伤的进一步发展,新生血管形成为运输修复所需的大量氧气、营养物质以及凝血因子等提供了结构基础。在正常的组织愈合过程中,炎症反应诱导巨噬细胞进入损伤部位,消化并清除凝块,提供生长因子,且成纤维细胞逐渐增多,血管增多,氧气与营养物质的输送得到满足;在肌腱重塑过程中,肉芽组织逐渐被新合成的胶原所替代,成纤维细胞进入凋亡程序,最终形成细胞密度较低的瘢痕组织。Ⅲ型胶原的合成在早期的修复过程中会有所增加,但随着新的Ⅰ型胶原的合成并参与组织修复过程,Ⅲ型胶原会逐渐减少[22]。

本研究中,损伤后愈合部位的组织主要为致密的瘢痕组织,且其抗拉能力较正常肌腱组织弱。这一结果与BUTLER 等[23]的研究报道相同。一项涉及绵羊模型跟腱横断和部分切除的研究结果表明,伤口部位似乎可在没有术后固定的情况下自动愈合,并在12个月内获得了足够的稳定性,而不需要手术重新建立组织连接[24]。所有的绵羊在至少6周后都恢复了部分负重能力,并且在至少8周后没有表现出跛行或步态限制,然而与正常组织相比,伤口部位仍然较弱(承受最大载荷较低)。另一项兔膑腱损伤模型实验研究结果显示,在造成髌腱缺损损伤仅1.5个月后,修复组织就达到了正常组织最大载荷的7%～9%,然而,到损伤后3个月和6个月时,修复组织最大载荷分别仅为正常组织的11%和8%[25]。本研究结果表明,不同肌腱损伤所致的肩袖损伤自然愈合结果是不同的。部分损伤和L 型损伤后,肩胛下肌实验侧/对照侧最大载荷百分比均低于新月型损伤,3组间杨氏模量比较也得到相同的结果。其主要原因是肩袖损伤类型的不同,不同的损伤类型可导致肌腱下肌不同程度的收缩,损伤处分离,出现缺口,进而导致结缔组织浸润的范围不同。其中以L 型损伤收缩最为明显,因此结缔组织填充较多,愈合后承受负荷的能力较弱。新月型损伤愈合良好的原因可能是,两边的肌腱组织为结缔组织的浸润填充起到了框架的作用,肩胛下肌收缩较少。损伤愈合较差的次要原因是脂肪浸润,脂肪浸润是肩袖撕裂中肩袖肌肉的主要退行性改变之一,且已被证明对肌腱修复愈合的结果有负面影响[26]。脂肪浸润的一个可能原因是肌腱损伤后肌肉萎缩,牵拉神经,使神经肌轴受损,继而出现脂肪细胞堆积浸润[6]。本实验缺陷为样本量小且未对脂肪浸润进行定量检测;另外,与人不同的是,兔肩关节基本不进行外展活动,而人的肩关节损伤后有可能活动范围增大而导致进一步损伤。

综上所述,本研究建立了不同类型兔肩袖损伤模型,并进行了生物力学与组织学评价,结果表明不同损伤类型对肩袖损伤自然愈合的影响不同,新月型损伤愈合较部分损伤及L 型损伤更好。在接下来的实验中,可建立不同时间的不同类型的肩袖损伤模型,探究损伤类型对肌腱脂肪浸润的影响;或是建立不同损伤类型模型后,给予相同的修复处理,观察不同损伤类型对修复效果的影响。