不同温度作用下草鱼胚胎的发育及hsp70基因表达

邱裕明，林 旺，郭红会，张 策，李 莉，李大鹏

( 华中农业大学 水产学院，池塘健康养殖湖北省工程实验室，水产养殖国家级实验教学示范中心，湖北 武汉 430070 )

草鱼(Ctenopharyngodonidella)作为我国四大家鱼之一，在水产行业中占有重要的地位，根据2019年中国渔业统计年鉴数据，草鱼以5.5043×106t的产量位居淡水养殖鱼类产量第一[1]。相对来说，草鱼与其他水产动物一样，在个体发育的早期阶段，其死亡率最高。然而，在自然条件或人工饲养条件下，常常会发生由天气变化、给排水、活鱼运输等原因引起的温度骤变，对鱼类胚胎的发育和存活、幼鱼生长等造成严重的影响。在研究水温对异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)“中科3号”[2]胚胎发育的影响中发现，孵化温度变化对于胚胎孵化过程影响较大，若水温过低会减缓胚胎发育速度，当孵化温度高于28 ℃，不仅会使孵化率显著降低，胚胎畸形率也显著升高，当水温达到32 ℃时胚胎发育最差，孵化率仅为(2.3±1.0)%。亦有报道称，胚胎不同发育阶段对温度的敏感程度不同。于欢欢等[3]认为，原肠中期可能是杂交子代胚胎发育过程中一个受温度影响的重要敏感期。周鑫等[4]发现，短期内当水温超过28 ℃时，草鱼幼鱼体内氧自由基增加，极大影响其免疫应答，最终将导致草鱼幼鱼的大规模死亡。可见，适宜的温度对鱼类维持正常的生理活动具有重要作用，其对胚胎发育的影响也会进一步影响到仔鱼的孵化率和存活率。早在20世纪80年代就有一些有关水温对鱼类胚胎发育影响的研究[5-9]。如薛家骅[8]将胚胎置于14～15、24～27、32～33 ℃孵化，发现温度可影响胚胎发育时间；郭永灿[9]分析认为，草鱼胚胎发育最适温度为23～28 ℃。然而上述研究大部分停留在表观指标的统计上，如孵化率、畸形率、死亡率、胚胎各阶段发育历时、胚胎形态等，缺乏对不同温度下鱼类胚胎潜在的适应或影响机制的研究。

热休克蛋白(hsp)家族具有协助变性蛋白复性以应对机体产生的不良影响的作用[10]，是对温度极为敏感的分子标记[11-12]。这其中，hsp70是最主要、最保守、细胞内含量最丰富的一类，它广泛地参与了稳定新生多肽过程[13]，具有帮助蛋白质进入线粒体和内质网[14]等功能。已有研究证明，热应激会诱导机体内hsp70基因相对表达量的上升[15-17]，不仅可以协助鱼类抵御高温应激，也有助于耐受其他应激源的刺激[18]。尽管生物体内存在调控机制以应对外界环境变化，但一旦超过其承受限度，将有可能会对机体造成不可逆的伤害。

笔者以草鱼胚胎为研究对象，通过设置不同温度梯度，探究温度对草鱼胚胎孵化耗时、孵化率、畸形率、初孵仔鱼体长等生物学指标的影响，并测定初孵仔鱼hsp70基因的表达动态，旨在为草鱼的发育生物学提供基础资料，同时为生产上草鱼苗种繁育以及资源增殖提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在湖南省岳阳市华容县田家湖水产场进行。选用基地驯化多年的草鱼亲本，人工催产后，采集干法人工授精的草鱼胚胎作为试验对象。水源为曝气24 h以上的自来水，孵化容器为圆筒形塑料桶，每个桶内装有1 L曝气水，通过水浴控制桶内水温。

1.2 试验方案

设置22、25、28、31 ℃ 4个温度组，每组3个平行，温差不超过±0.5 ℃。每个孵化桶内置刚孵化的草鱼卵150个，孵化过程中微曝气，保证鱼卵在水中翻动且卵膜不会被气流冲破。为准确地统计胚胎受精率，每个温度组另设3个孵化桶，各置100个草鱼卵，待胚胎发育至原肠胚期后测定受精率。孵化过程中定期选择不同温度一定数目的胚胎在显微镜下观察其发育情况，待鱼苗全部孵化记录孵化时长，并统计孵化率、畸形率，计算有效积温和温度系数Q10。每组随机选取30尾初孵仔鱼，记录体长。收集不同温度组的初孵仔鱼样品，立即冻存于液氮中直至检测。

试验各项指标按下式计算：

F=n1/n2×100%

(1)

H=n3/(n2×F)×100%

(2)

M=n4/n3×100%

(3)

K=N(T-C)

(4)

(5)

(6)

式中，F为受精率(%)，H为孵化率(%)，M为畸形率(%)，n1为受精卵数(个)，n2为观察卵子总数(个)，n3为孵出仔鱼数(尾)，n4为畸形仔鱼数(尾)；K为胚胎发育的有效积温(℃·h)，N为胚胎完成发育所需要的时间(h)，T为胚胎发育的水温(℃)，C为胚胎发育的生物学零度(℃)；n为试验设计的温度梯度个数，V为胚胎发育所需要时间的倒数(1/N)，即发育速率；Q10[5]表示温度改变10 ℃时发育速度加快的倍数，Z0和Za分别表示温度t0和ta时胚胎孵化持续的时间(h)。

1.3 荧光定量PCR

使用TRIzol试剂盒提取胚胎样品总RNA，利用NanoDrop ND-2000分光光度计(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)和1.2%琼脂糖凝胶电泳检查总RNA浓度和完整性。取1 μg总RNA，用PrimeScriptTMRT Reagents反转录试剂盒合成cDNA(TaKaRa)，并保存于-20 ℃冰箱直至检测。

使用Primer Premier 5.0软件设计基因特异性引物(表1)。在LighrCycler®480实时PCR检测系统(Roche, Basel, Switzerland)上检测hsp70基因相对表达量。PCR反应体系总量20 μL：2 μL cDNA模板，10 μL iQTMSYBR®Green Supermix，上下游引物(0.25 μmol/L)各0.8 μL，6.4 μL双蒸水。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，进行40个循环。本次试验以β-actin基因为内参基因，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量比(R)。qPCR分析中使用6个生物学重复。

表1 荧光定量PCR所用引物序列

1.4 统计分析

利用SPSS 20.0对所有数据进行单因素方差分析和LSD多重比较，并数据表示为平均值±标准误(n=6)。采用字母标记法表示每个数值之间的差异显著性。

2 结 果

2.1 温度对草鱼孵化率和畸形率的影响

草鱼胚胎的孵化率随着温度升高先上升，在28 ℃达到最高[(97.00±1.81)%]，而31 ℃条件下孵化率显著降低，仅为(31.51±1.84)%(P<0.05)(图1)。温度对畸形率的影响更为明显，随着温度升高畸形率显著降低(P<0.05)，在28 ℃达到最低值[(2.08±1.06)%]，31 ℃，大部分不能正常发育，畸形率达(90.00±5.79)%。通过回归分析，得到孵化率(y)同温度(x)之间的回归方程：y=-0.0192x2+0.9695x-11.246(r2=0.872)；畸形率(y)同温度(x)之间的回归方程：y=0.0271x2-1.3608x+17.035(r2=0.931)。

图1 不同温度条件下草鱼胚胎孵化率和畸形率Fig.1 The hatching rate and malformation rate of grass carp C. idella embryos at different temperatures数据用平均值±标准误表示(n=6)，不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)；下同.Data are expressed as mean±standard error (n=6), and means with different letters are significant difference (P<0.05)；et sequentia.

2.2 温度对胚胎孵化耗时和有效积温的影响

随着孵化温度的升高，孵化耗时显著降低(P<0.05)(表2)。相对的，草鱼胚胎孵化的有效积温在22～28 ℃随温度的升高而显著增加(P<0.05)，28 ℃时达到最大值，为(351.48±4.04) ℃·h，随后在31 ℃显著下降(P<0.05)。

表2 不同温度条件下草鱼胚胎发育时间和有效积温

试验温度为22～31 ℃，Q10变化为1.77～2.27，其中25～31 ℃温度带内的Q10值为2.05，接近2(表3)。

2.3 温度对初孵仔鱼体长的影响

随着孵化温度的上升，初孵仔鱼的体长呈现先增后降的趋势，其中22 ℃组体长最小，28 ℃体长最大，25 ℃和28 ℃之间无显著差异，其他组之间差异显著(P<0.05)(图2)。通过回归分析，得到初孵仔鱼体长(y)同温度(x)之间的回归方程：y=-0.0357x2+1.9394x-21.138(r2=0.999)。

2.4 温度对初孵仔鱼hsp70基因相对表达水平的影响

对初孵仔鱼体内hsp70基因的检测发现，随着温度的上升，其相对表达水平显著上升(P<0.05)，且在28 ℃达到最高，28 ℃和31 ℃之间差异不显著(图3)。

图3 不同温度条件下草鱼仔鱼hsp70基因相对表达量Fig.3 Relative expression level of hsp70 gene of grass carp C. idella larvae at different temperatures

3 讨 论

3.1 不同温度对草鱼胚胎发育的影响

鱼类胚胎在发育过程中对水温的变化较为敏感，高温或低温的刺激往往会导致胚胎发育畸形、滞育，甚至死亡[5]。本试验结果显示，随着孵化温度的上升，草鱼胚胎的孵化率和初孵仔鱼的体长先上升，而后在31 ℃组显著下降；相反的，畸形率在22～28 ℃先下降，在31 ℃下显著上升。姜礼燔等[19]将草鱼卵在36 ℃下急性暴露1、5、10、40 min，或在10 ℃暴露5、10、15、30 min后，再将鱼卵移至19～21 ℃水体内孵化，发现高温组内4种处理时间均使孵化率降低，而在低温下暴露超过30 min也会使胚胎发育迟缓或畸形。在对黑莓鲈(Pomoxisnigromaculatus)[5]、淇河鲫(Carassiusauratus)[6]、尖裸鲤(Oxygymnocyprisstewartii)[20]、四川华鳊(Sinibramataeniatus)[21]等鱼类的研究中也有类似的结果，即在适宜的温度范围内，随着温度升高，胚胎发育的孵化率增加，但是温度过高或过低反而会影响孵化率，并导致胚胎发育畸形。事实上，作为胚胎发育过程中的主要营养来源，卵黄物质一方面提供能量，一方面也为胚胎组织、器官的构建提供物质基础，而这其中需要大量酶的参与[22]。在温度较低的情况下，酶的活性被抑制，阻碍胚胎细胞的代谢，使发育时间延长，如在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的研究中发现，水温的降低会延长受精第一、第二极体的释放时间，最终影响孵化耗时[23]。而在温度较高时，酶活性亦有可能被抑制，甚至失活，导致胚胎细胞膜的渗透性发生变化，分化过程紊乱，致使受精卵的正常发育严重受阻[24]。这可能是本试验中31 ℃下草鱼胚胎几乎全部畸形的原因之一。除此之外，也有研究认为，胚胎某些结构可能对高温更加敏感[25]。

本试验结果显示，草鱼胚胎孵化耗时随着温度的升高显著下降，但有效积温随着温度的升高显著上升，在28 ℃达到最大值，随后在31 ℃下显著下降。有效积温代表胚胎发育过程中累计所必需的热量总数，理论上是个常数，但在异育银鲫[2]、扁吻鱼(Aspiorhynchuslaticeps)[26]、玫瑰无须鲃(Puntiusconchonius)[27]等研究中均发现，当孵化温度变化时，有效积温会随之出现波动。前期研究也证明，胚胎发育的不同阶段对温度变化的敏感性可能不同[5,26-28]。这或许说明温度对胚胎的作用机制并不仅限于量的积累，还可通过参与调控胚胎发育过程中复杂的分子途径，影响其代谢及器官分化等过程，因此有效积温在一定范围内波动。一般认为，温度系数Q10越接近2，该温度带内水温变化对胚胎发育的影响越小，即该温度范围为所研究对象的最适温度范围。本试验结果发现，25～31 ℃温度带内的草鱼胚胎发育Q10值为2.05，接近2，结合此温度范围内孵化率和畸形率的变化，可进一步认为草鱼胚胎发育最适温度应为25～28 ℃。

3.2 不同温度对草鱼胚胎hsp70基因表达的影响

温度胁迫会导致机体活性氧增加，进而引起蛋白质的错误折叠，使蛋白质失活，影响机体生理过程。此时热休克蛋白的大量转录翻译可重折叠变性蛋白，阻止更多蛋白聚集，以维持机体稳态[29-31]。不仅如此，胚胎在发育过程中有大量蛋白质合成，热休克蛋白对新合成蛋白质也具有一定的保护作用[13]。已有研究发现，高温可诱导鸡[32]、牛[33]、蜥蜴[34]等动物体内hsp70基因mRNA水平上升。有关鲑鱼的研究表明，水温由15 ℃升至22 ℃时，鲑鱼体内hsp70基因水平急剧增加[35]。Mottola等[36]将斑马鱼(Daniorerio)在高于正常饲养水温5 ℃或7 ℃ 暴露30 min后，发现斑马鱼体内hsp70基因的相对表达量显著上升，且在+7 ℃组内hsp70水平也出现上调。Hallare等[37]在对斑马鱼胚胎所做的温度—镉联合暴露试验中发现，相对于低温组(21 ℃)，对照组(26 ℃)和高温组(33 ℃)胚胎中hsp70基因相对表达量上升，胚胎抵御镉刺激的能力增强，从而使得死亡率降低、平均心率升高。类似的，低温胁迫也可诱导hsp70基因的表达，如虎皮鱼(Puntiustetrazona)脑、鳃和肌肉组织中hsp70基因mRNA水平随温度降低而逐渐升高，表现为温度依赖性表达[38]。本试验结果显示，孵化温度的上升促使草鱼初孵仔鱼体内hsp70基因相对表达量的上升，表明草鱼可通过调节热休克蛋白hsp70基因的表达量以适应温度的变化，保护胚胎的正常发育。

然而，热休克蛋白仅能在一定水平的应激强度范围内保护机体[4,39,40]，如将文蛤(Meretrixmeretrix)长时间暴露于pH过高或过低的环境中，均会导致其机体内hsp70基因表达量的下降[41]。Cardoso等[39]将北美鲳鲹(Trachinotuscarolinus)幼鱼暴露于高温环境下，检测到鱼体内hsp70基因和p53基因相对表达量随温度升高而上升，在36 ℃组则显著降低，并伴随着行为失常，死亡率升高。周鑫等[4]在草鱼幼鱼急性温度变化暴露试验中也发现，鳃和肌肉中的hsp70基因和hsp90基因的相对表达量随温度升高而升高，继而在34 ℃组降低，死亡率也迅速提高。通过整合基因相对表达量、耗氧率及半致死温度数据发现，草鱼hsp基因的表达过程需要能量的支持，且同机体代谢显著相关，并进一步证实，草鱼的生理临界温度为28 ℃[4]。事实上，由于hsp基因家族大多数成员没有内含子，在应激条件下，hsp70基因的mRNA会优先转录翻译，而其他蛋白的mRNA转录翻译则会受到抑制[11,41]。本试验中，28 ℃组hsp70基因相对表达量达到最高值后，31 ℃组没有进一步升高，这可能是由于胚胎发育过程中并没有外源性营养，不断合成热休克蛋白势必会影响其他蛋白的合成，导致机体组织细胞膜结构和蛋白质组成异常，最终也会使胚胎发育受阻。本试验hsp70基因的mRNA水平的变化一方面说明28 ℃可能已达到草鱼维持胚胎正常发育的极限温度，另一方面，可能正是因为31 ℃组热休克蛋白合成量无法继续升高，不足以抵御高温侵袭，最终导致了孵化率的降低和畸形率的升高。

4 结 论

本试验结果显示，水温25～28 ℃时，草鱼胚胎的受精率、孵化率、有效积温和初孵仔鱼体长均较高，而孵化耗时，畸形率较低，结合Q10数据分析，建议草鱼胚胎孵化的最适温度为25～28 ℃。同时，hsp70基因相对表达水平在25～31 ℃随温度升高先升后降，表明草鱼可通过调节hsp70基因的表达量以适应温度的变化，保护胚胎的正常发育，且28 ℃可能是胚胎正常发育的极限温度。