响应面法优化提取仿刺参中海参皂苷工艺

刘桂英，王旭达，葛 坤，胡超魁，吴金浩，李 爱，郑 杰，周遵春

( 1.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023； 2.大连海洋学校，辽宁 大连 116023 )

仿刺参(Apostichopusjaponicus)是食用海参中经济价值较高的海参之一，具有多种药理活性成分。研究表明，海参皂苷是主要的活性物质[1]，自1952年Nigrelli等[2]报道了一种从海参体内的居维氏管中分离得到的毒素——海参皂苷以来，已发现并确定结构的海参皂苷有100多种。海参皂苷在体外被证实具有不同程度的抗真菌作用、溶血作用、细胞毒作用、抑制新生血管、调节生长发育等生物活性[3-8]，可作为新型药物的候选化合物和先导化合物，具有巨大的开发应用价值。

海参皂苷的提取方法有索氏提取法、溶剂浸提法、水煮法、超声波提取法[9]等。于林芳等[10]通过60%乙醇加热回流提取海参皂苷，需要3～5 h完成提取；利用大孔吸附树脂对革皮氏海参(Pearsonothriagraeffei)中总皂苷进行吸附、解吸试验，经过树脂的纯化，得到较高纯度的总皂苷[11]。丛日山等[12]采用水煮法提取海参皂苷，提取时间较长。传统的提取方法在提取率、耗时、耗能等方面具有很大的改进和提升空间。微波辅助提取法是近年来新兴的提取方法，具有加热速度快，提取时间较短，提取效率高等优点。赵丽蓉等[13]采用微波辅助萃取提取黄精药材中的总皂苷，提取条件为：乙醇体积分数为50%，料液体积比为1∶16，提取时间为40 s。兰艳素等[14]采用微波辅助萃取提取广豆根中的总黄酮，提取时间仅需3 min，提取率较高。微波辅助萃取技术主要应用于中草药中皂苷的提取，尚未见采用微波萃取技术提取仿刺参中海参皂苷的研究报道。因此，笔者结合微波辐射所具有的特点，采用单因素与响应面优化相结合的方法[15]对海参皂苷提取工艺进行优化，考察微波萃取的最佳提取条件，建立仿刺参中海参皂苷的提取工艺，为仿刺参资源的开发和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

仿刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心，均为3龄参。乙醇、甲醇(分析纯，国药集团)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；固相萃取柱(美国Waters公司，Oasis HLB，6 cc，500 mg)；皂苷标准品Cladoloside A(CA)由本实验室提供。

1.2 仪器设备

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、配有二极管阵列检测器(DAD)、氮吹浓缩仪(天津市恒奥科技发展有限公司)、Milli-Q超纯水仪(美国Milliopore公司)、微波萃取仪(美国CEM公司)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、高速组织捣碎机(德国IKA公司，T18 digital)、固相萃取仪(美国色谱科公司)、真空冷冻干燥机(德国Marin Christ公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 样品液的制备

取3～5头仿刺参置于冰盘中，取出内脏，将体壁切成小块，放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥48 h。取出捣碎成粉末, 取粉末约0.5 g，加入体积分数70%的乙醇溶液25 mL，微波辅助萃取仪萃取，萃取时间为10 min，爬坡时间为5 min，温度为45 ℃，萃取功率为400 W，微波萃取3次，将萃取液合并，50 ℃真空旋转蒸发至无乙醇味，加水至10 mL，将含有皂苷的待测溶液全部转入活化后的固相萃取柱(活化过程为先用2.0 mL甲醇活化，再用5.0 mL纯净水平衡，保持湿润)，保证2滴/s的流速，抽干小柱，用体积分数为10%的甲醇溶液5.0 mL进行淋洗，最后用纯甲醇5.0 mL作为洗脱剂进行洗脱，抽干小柱，收集全部流出液，50 ℃水浴浓缩，氮吹仪氮吹至液面高度恒定，用甲醇定容1.0 mL，上清液经有机相滤膜0.22 μm过滤至进样瓶中，进行高效液相色谱分析。

1.3.2 色谱条件

根据文献[16]及试验结果，确定如下液相色谱仪的色谱条件。色谱柱：Zobax SB-CN色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；波长：205 nm；柱温：30 ℃；流动相：A为纯净水，B为乙腈；流速：1.0 mL/min；梯度洗脱程序：起初1～5 min为70% A，5～30 min为50% A，35 min为70% A；进样体积：10 μL。

1.3.3 标准溶液配制

准确称取适量海参皂苷CA(精确至2.0 mg)标准品，用色谱纯乙腈溶解，配制质量浓度为2 mg/mL的标准储备液，4 ℃保存，临用时稀释成所需用量。

1.3.4 单因素试验设计

在相同条件下，选用微波萃取仪对同一样品设置不同功率进行提取，微波功率的设置为400、600、800 W。通过试验发现，相同条件下，600 W和800 W的功率较高，样品经过萃取之后，海参皂苷基本被破坏，未检出皂苷含量。这是由于随着微波功率的增大，电磁波发射出的频率越大，物质内部产生的热能越大，提取率逐渐增大；而功率过高，有效成分破坏，提取率减小；因此，选择微波功率为400 W。

参照文献[17-19]以及预试验，最终确定考察乙醇体积分数，溶剂体积、时间、温度4个因素，按上述条件进行样品制备：(1)固定时间为10 min、微波功率为400 W、溶剂体积为25 mL、温度为45 ℃，设置乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90% 5个水平；(2)固定提取时间为10 min、微波功率为400 W、溶剂体积为25 mL、乙醇体积分数为70%，设置提取温度为35、45、55、65、75、85 ℃ 6个水平；(3)固定乙醇体积分数为70%、微波功率为400 W、溶剂体积为25 mL、温度为45 ℃，设置时间为5、10、15、 20、25 min 5个水平；(4)固定乙醇体积分数为70%、微波功率为400 W、时间为10 min、温度为45 ℃，设置溶剂体积为10、15、20、25、30 mL 5个水平。

1.3.5 响应面试验设计

在单因素试验基础上，用Design-Expert 8.0.6进行响应面中心组合试验设计，以时间(A)、温度(B)、乙醇体积分数(C)3个因素为自变量，海参皂苷CA提取率为因变量，海参皂苷CA含量为响应值，设计三因素三水平的响应面试验，以优化海参皂苷CA的提取方法。因素水平见表1。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平

1.3.6 海参皂苷得率的计算方法

样品中总皂苷含有量以海参皂苷CA计。海参皂苷CA为本实验室自制，利用液相色谱质谱联用仪、红外光谱以及核磁共振仪确定其化学结构，经高效液相法检测，确定纯度大于95%。海参皂苷CA自仿刺参体壁提取纯化获得，含量较高，具有一定的代表性，因此，选择海参皂苷CA提取率为评价指标，计算公式如下：

式中，wCA为海参皂苷CA提取率(‰)，m1为提取海参皂苷CA质量(mg)，m为仿刺参样品质量(mg)。

1.4 验证试验

称取仿刺参样品粉末约0.5 g，按响应面法优化的提取方法进行海参皂苷CA的提取测定，平行3次，以验证提取方法的可行性及重现性。称取不同规格的雌、雄仿刺参样品进行海参皂苷的测定，以验证方法的准确性，并进一步讨论海参皂苷提取率在不同规格仿刺参中的变化。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱检测方法的建立

精密吸取标准储备液(1.3.3)若干体积，用色谱纯甲醇配制成质量浓度为0.005、0.015、0.050、0.150、0.500、1.000 mg/mL的系列标准溶液，以质量浓度(x，mg/mL)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，得到目标化合物的线性回归方程y=1264x+2.917和相关系数r=0.9990。结果表明，海参皂苷CA在0.005～1.000 mg/mL质量浓度内呈良好的线性关系，以3倍和10倍信噪比确定该化合物的仪器检出限和定量限，分别为0.0015 mg/mL和0.005 mg/mL。向样品中分别添加10、20、50 μg/g的海参皂苷CA，每个水平测定5份平行样品，考察方法的回收率和精密度，平均回收率分别为63.7%、89.3%和94.4%，精密度分别达到3.5%、1.3%和2.2%。

2.2 单因素试验结果与分析

按照1.3.1中样品的制备方法，通过加标回收率考察萃取溶剂体积分数、温度、时间和溶剂体积等因素对海参皂苷CA提取率的影响，结果见图1。采用体积分数70%乙醇提取海参皂苷CA，海参皂苷CA提取率较高。随着乙醇体积分数的升高，海参皂苷CA的提取率逐渐降低，由于海参皂苷CA的极性较大，根据相似相溶的原理，海参皂苷CA的溶解率降低，因此选择体积分数70%乙醇作为提取溶剂为最佳。由于微波萃取罐的最大体积为30 mL，由10 mL逐渐增加溶剂体积，直至30 mL。当溶剂体积为25 mL时，海参皂苷CA的提取率较高。当时间为10 min的时候，海参皂苷CA的提取率较高，继续延长提取时间，海参皂苷CA提取率反而降低，但在25 min时，提取率升至10 min时的水平，这可能是提取时间长，部分皂苷发生了降解，生成了海参皂苷CA的缘故，但不是仿刺参体内的已有海参皂苷，因此选用10 min较为合适。微波设置温度在35～85 ℃内，45 ℃时，海参皂苷CA提取率较高，随着温度的升高，提取率逐渐下降，可能是温度高，海参皂苷发生了降解的缘故，选择45 ℃为最佳提取温度。

图1 单因素试验设计结果Fig.1 The results of single factor experiment

2.3 响应面法试验结果与分析

根据单因素试验结果，选取时间(A)、温度(B)、乙醇体积分数(C)3个因素进行Box-Benhken响应面优化。其中1～12组试验为析因设计，13～17组试验为中心设计；零点试验共设计5组，用以估算试验误差；响应面设计以A、B、C为自变量，以海参皂苷CA提取率(y)为因变量，设计方案见表2。

表2 微波提取海参皂苷CA的响应面分析方案与结果

通过对表2中的数据进行回归分析，得出回归方程为：y=15.08+0.65A-0.20B-1.65C-1.10AB+0.30AC-3.00BC-4.19A2-2.94B2-3.34C2，并作出响应面图和等值线图，对该模型进行响应面分析，得出二次响应回归模型的方差分析，分析结果见表3。

响应曲面三维图能够直观地反映各因素对响应值的影响程度和因素间交互作用的强弱。等高线的形状反映出交互作用影响效应的强弱与大小[24]。采用Design-Expert 8.0.6软件对结果进行响应面分析，结果见图2。当乙醇体积分数固定时，海参皂苷CA提取率随着时间的延长和温度的升高而增加(图2)。提取时间由5 min增至15 min，海参皂苷CA的提取率增加。随着时间的延长，海参皂苷CA提取率先升后降。微波使细胞壁破裂，增加了海参皂苷CA的溶解度，而温度过高，海参皂苷CA发生降解，导致提取率降低。当温度固定时(图3)，随着乙醇体积分数的增加，海参皂苷CA提取率明显增大，但时间较短或较长均导致海参皂苷CA的提取率降低。当时间固定时，随着乙醇体积分数和温度的升高，海参皂苷CA提取率提高至最大值，但随着乙醇体积分数的增大和温度的升高，海参皂苷CA提取率有所降低(图4)。因此，模型显示，在适当条件下，海参皂苷CA的提取率最高。

图4 微波提取温度和乙醇体积分数对海参皂苷CA提取率交互作用的响应面立体图和等高线图Fig.4 Response surface stereogram and contour map of the interaction between microwave temperature and different concentration of ethanol on sea cucumber saponin CA yield

2.4 模型验证试验

根据所得到的模型，经Design-Expert 8.0.6软件处理的最优工艺条件：微波功率400 W，溶剂为体积分数70%乙醇，温度为45 ℃，次数为3次，时间为10 min。在此条件下，海参皂苷CA理论上的含量达150.8 μg/g，实际进行3组验证试验，结果分别为153.6、149.5、152.3 μg/g，取其平均值为151.8 μg/g，与理论值较为接近，表明数学模型对优化海参皂苷CA的提取工艺可行。

通过本试验建立的优化方法对不同规格的雌、雄仿刺参进行海参皂苷的测定，进一步验证试验的准确性，其结果见表5。雌、雄仿刺参体壁海参皂苷CA含量相似，大规格海参皂苷CA含量变化不大。

表5 仿刺参不同规格海参皂苷CA的含量

3 讨 论

3.1 方法学讨论

方法学考察的结果表明，当海参皂苷CA质量浓度为0.005～1.000 mg/mL，标准对照品线性关系良好，仪器和样品溶液的精密度和重复性较高，且加样回收率较佳，所优选的高效液相色谱测定皂苷成分的色谱条件和提取方法符合试验要求。

3.2 提取方法的比较

为了考察不同提取方法对提取效果的影响，笔者分别采用微波辅助提取法、索氏提取法和超声波提取法进行比较，结果显示，索氏提取法和微波辅助提取法的提取率相当，但是索氏提取法消耗时间长，每批次检测样品量少。相同条件下，超声波提取法的提取率较低。微波辅助萃取法采用了微波的辐射功能，增加了溶剂的穿透力，加深了需提取成分在溶液中的释放扩散，提高了物质的提取速度和工作效率，具有高效性和强选择性，且适合大批量样品提取分析。因此，本试验选择微波辅助提取法进行提取。

3.3 响应面优化讨论

采用单因素法对皂苷微波辅助提取方法中、乙醇体积分数和体积、温度和时间进行优化，并在此基础上采用Box-Benhken试验设计和响应面分析法进一步优化，以提高海参皂苷CA的提取率。响应面法是集试验设计、数学统计和计算机科学为一身的优化方法，不仅可以搜寻出各因素的最优水平区域，而且可以考察各因素对响应值及各因素之间的交互作用，其为全局性优化，试验点数少，试验信息量大，已广泛应用于化工、医药、生物和农业等研究领域的工艺优化[25-29]。采用Box-Benhken试验设计方法，以较少的试验次数获得提取条件与海参皂苷CA成分之间的相关信息，多元二次回归分析模型及响应曲面能较好地描述提取条件与海参皂苷CA提取率之间的相关性以及提取条件之间的交互作用。通过响应面分析，优化了海参皂苷的提取工艺，试验值与模型理论预测值仅相差0.1%。因此采用响应面分析优化得到的提取条件参数准确可靠，可用于实际操作。王琴等[30]用该方法对金柚幼果总黄酮进行提取优化，兰艳素等[14]用该方法对广豆根中总黄酮进行了优化，均获得了较高的提取率，说明该方法切实可行。

4 结 论

采用响应面法分析优化微波辅助萃取法，以海参皂苷CA的含量为评价指标，在单因素试验基础上，确定时间、温度和溶剂体积分数3个自变量，建立了微波辅助提取仿刺参中海参皂苷CA的提取率与影响因素之间的模型关系，并最终确立微波辅助提取海参皂苷CA的最佳工艺条件：在微波功率为400 W的条件下，采用70%乙醇25 mL对样品进行提取，微波加热时间为10 min，温度为45 ℃，在此条件下的海参皂苷的提取含量可达到151.8 μg/g。试验结果可为该技术的应用提供参考和依据，为合理开发利用仿刺参提供科学依据。