百里香醌调控Caspase-3/Bax/Bcl-2信号通路诱导人皮肤鳞状细胞癌增殖和凋亡的作用机制研究

周晓谦 金星姬 杨竹生 杨秀敏

[摘要]目的：探讨百里香醌对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、凋亡的影响及可能机制。方法：将A431细胞分为对照组，低、中、高浓度实验组，对照组采用DMEM培养，而低、中、高浓度实验组分别采用含1、15、30μg/ml百里香醌的DMEM培养。MTT法检A431细胞增殖;台盼蓝法观察A431细胞存活;划痕试验检测各组A431细胞迁移;免疫荧光法检测Bax和Bcl-2蛋白表达;Westernblot检测各组A431细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表达。结果：百里香醌能有效抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖，且呈浓度及时间依赖性;台盼蓝法显示，百里香醌浓度增加使A431細胞死亡率上升，呈浓度依赖性;与对照组比较，低、中、高浓度实验组A431细胞迁移能力降低;与对照组比较，经百里香醌处理后A431细胞Bax表达增加，Bcl-2表达降低;Western blot检测结果显示，与对照组比较，不同浓度百里香醌处理后A431细胞Bax、cyto-C、caspase-3和PARP表达水平增加，而Bcl-2表达下降。结论：百里香醌具有抑制A431细胞增殖、侵袭以及诱导凋亡的作用，其机制可能是Bax/Bcl-2比值升高，促使释放至胞浆中Cyto C增加，进而激活Caspase-3以及PARP蛋白有关。

[关键词]百里香醌;人皮肤鳞状细胞癌;增殖;凋亡;迁移

[中图分类号]R739.5    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）06-0114-04

Thymoquinone Regulates Caspase-3/Bax/Bcl-2 Signaling Pathway and Induces Proliferation and Apoptosis of Cutaneous Squamous Cell Carcinoma

ZHOU Xiao-qian，JIN Xing-ji，YANG Zhu-sheng，YANG Xiu-min

（Department of Dermatology，Beijing Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China）

Abstract： Objective  To investigate the effect of thymoquinone on the proliferation and apoptosis of human cutaneous squamous cell carcinoma A431 cells and its possible mechanism. Methods  A431 cells were divided into the control group and the low， medium and high concentration experimental groups. The control group was cultured with DMEM， while the experimental-L， M， H groups were cultured with DMEM containing 1， 15 and 30 μg/ml thymoquinone， respectively. The proliferation of A431 cells was detected by MTT. The survival of A431 cells was observed by trypan blue method. The migration of A431 cells was detected by scratch test. The expression of Bax and Bcl-2 protein was detected by immunofluorescence. The expression of Bax， Bcl-2， Caspase-3， Cyto C and PARP protein in A431 cells were detected by Western blot. Results  Thymoquinone can effectively inhibit the proliferation of human skin squamous cell carcinoma A431 cells in a concentration and time-dependent manner. Trypan blue assay showed that the mortality of A431 cells increased with the increase of thymoquinone concentration. Compared with the control group， the migration ability of A431 cells in the experimental-L， M， H groups was decreased. Compared with the control group， the expression of Bax increased and the expression of Bcl-2 decreased in A431 cells treated with thymoquinone. Compared with the control group， the expression levels of Bax， Cyto-c， Caspase-3 and PARP were increased in A431 cells treated with different concentrations of thymoquinone， while the expression of Bcl-2 was decreased. Conclusion  Thymoquinone can inhibit the proliferation， invasion and induce apoptosis of A431 cells. The mechanism may be related to the increase of the ratio of Bax/Bcl-2， the increase of Cyto C released into the cytoplasm， and the activation of Caspase-3 and PARP protein.

Key words： thymoquinone; human cutaneous squamous cell carcinoma; proliferation; apoptosis; migration

人体皮肤是最直接与外界接触的器官，有助于吸收、分泌和免疫，是人体抵御外界有害物质侵入的第一道防线[1]。近年来，皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）在皮肤非黑色素细胞性恶性肿瘤中发病率居第二位，且呈增高趋势[2]。然而，许多公众对皮肤癌缺乏认识，导致延误诊断，影响及时有效的治疗，严重影响患者的健康和生活。黑种草籽油是从黑种草中提取的油类物质，百里香醌（Thymoquinone，TQ）是其中的主要活性成分，具有抗炎、抗微生物、抗氧化和免疫调节作用[3]。大量研究报道，百里香醌可以通过多种机制参与不同类型肿瘤细胞的抗癌作用，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌等[4-5]。但百里香醌关于鳞状细胞癌的作用机制尚未阐明，本研究旨在探讨百里香醌对A431细胞增殖、凋亡、迁移的影响，并探讨其可能机制。

1  材料和方法

1.1 试剂和仪器：百里香醌（美国Santa Cruz公司）;DMEM培养基（南京凯基生物科技发展有限公司）;多克隆Bcl-2相关X蛋白（BAX）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、细胞色素C氧化酶（Cyto C）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抗体（美国Cell Signaling Technology公司）;噻唑蓝（MTT）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）;转膜仪（美国，BIORAD）;多功能酶标仪（美国，Biotek）。

1.2 细胞株和分组：A431细胞来源于中国科学院上海细胞库，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培养，细胞置于5% CO2、37℃孵育箱中，相对湿度为（85±5）%，70%时融合后，可用于进一步的实验;将A431细胞分为对照组（Control），低、中、高浓度实验组，对照组采用DMEM培养基培养，而低、中、高浓度实验组分别采用含1、15、30μg/ml百里香醌的DMEM培养基培养。

1.3 MTT法检测百里香醌对A431细胞活力影响：用不同浓度（1、15、30μg/ml）的百里香醌处理A431细胞（1×106个/毫升），将处理后的细胞培养24、48和72h，用MTT法测定细胞活力，二甲基亚砜溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定其吸光值，细胞活力用阴性对照（0d）的相对百分比表示。

1.4 台盼蓝染色试验检测细胞存活：将A431细胞（1×106个/毫升）接种到6孔培养板中，并置于5% CO2、37℃孵育箱中培养过夜，然后用0、1、15和30μg/ml百里香醌处理细胞24h，胰蛋白酶消化，细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混匀，孵育3min后，在显微镜下观察（死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染）。

1.5 划痕试验检测百里香醌对A431细胞迁移：将各组A431细胞接种于6孔板中，待细胞生长至融合时，用无菌20μl枪尖垂直线性划痕，用PBS洗2遍，洗去细胞碎片和死细胞，加1 000μl培养基继续培养，划痕后0、24h拍照，比较各组间划痕愈合的差异。

1.6 免疫荧光法检测Bax和Bcl-2蛋白表达[6]：将百里香醌（0，15μg/ml）处理24h的A431细胞用4%多聚甲醛固定15min，然后PBS清洗，加入0.5% riton X-100处理15min（再次清洗），并用5%羊血清封闭30min，加入一抗Bax（1：2 000稀释）和Bcl-2（1：1 000稀释），4℃下孵育过夜，PBS冲洗细胞，加入FITC偶联抗兔IgG室温下孵育1h，冲洗，加入DAPI复染，用荧光显微镜检测观察。

1.7 Westernblot检测各组A431细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表达[7]：用百里香醌处理细胞48h，离心RIPA裂解液裂解细胞并提取蛋白，BCA法蛋白定量。每孔20μl上样，样品直接用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分离，将蛋白转至PVDF膜，于室温下用5%脱脂牛奶封闭2h，一抗4℃下孵育過夜，随后TBST洗膜，室温下与HRP结合的二抗孵育1h，用增强化学发光（ECL）化学发光试剂显色，曝光成像，使用Image J软件对得到的图像进行扫描和量化。

1.8 统计学分析：采用SPSS 7.0软件进行数据分析，所有数据用均数±标准差（x?±s）表示，通过单因素方差分析（ANOVA）进行多组比较，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 各组A431细胞增殖情况比较：与阴性对照组（0d）相比，经百里香醌（15、30μg/ml）治疗后细胞活力下降（P<0.05），且不同浓度百里香醌治疗后A431细胞活力逐渐降低呈剂量及时间依赖性，而经1μg/ml百里香醌治疗后，各时间点A431细胞活力无显著性差异（P>0.05）。见图1。

2.2 各组A431细胞活性比较：台盼蓝法观察发现，死细胞呈明显的蓝色染色，无色透明细胞为活细胞。对照组A431细胞呈圆形、无色、透明，形状规则，呈细胞间粘附，很少有蓝色染色的死细胞;经低浓度百里香醌处理后，观察到一些相互粘附的无色细胞，而一些细胞被染成蓝色，而百里香醌浓度增加会导致蓝色染色细胞缩小、数量相应增加，呈分散状。见图2。

2.3 百里香醌对各组A431细胞迁移影响：与对照组（0h）相比，24h后对照组划痕逐渐愈合;24h后中、高浓度实验组划痕距离大于对照组（0h）。见图3。

2.4 百里香醌对A431细胞Bax和Bcl-2蛋白表达影响：Bax和Bcl-2蛋白分布在细胞质中。与对照组相比，经15μg/ml百里香醌处理后A431细胞Bax表达增加，Bcl-2表达降低。此外，与对照组相比，还观察经百里香醌处理后活细胞（DAPI染色的蓝色细胞）数量减少，见图4～5。

2.5 百里香醌对A431细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表达影响：与对照组相比，经不同浓度百里香醌（0、1、15、30μg/ml）处理后A431细胞中Bax、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表达逐渐升高，而Bcl-2表达下降，见图6～7。

3  讨论

皮肤鳞状细胞癌（cSCC）是一种起源于表皮或附属器角质形成细胞的皮肤恶性肿瘤，严重危害人类健康[8]。尽管大部分皮肤鳞状细胞癌都能通过手术切除，但仍有部分cSCC可以通过复发、转移等途径导致死亡，对于这些高危型cSCC至今仍无有效治疗方案[9]。

百里香醌（TQ）作为一种天然活性成分，对多种恶性肿瘤如：肝癌、胰腺癌、大肠癌、肺癌、皮肤癌等均有治疗作用[10]。研究还发现，百里香醌在多种癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等过程中能起到抑制性作用[11]。然而，TQ对cSCC细胞增殖、迁移及凋亡的影响目前仍不明确，因此本研究探讨TQ是否通过Caspase-3/Bax/Bcl-2信号通路影响皮肤鳞状细胞癌A431的凋亡，为皮肤鳞状细胞癌的治疗提供相关的实验依据。

MTT法检测显示，与阴性对照（0d）相比，不同浓度百里香醌（15、30μg/ml）治疗后A431细胞活力下降，且随时间延长而逐渐降低，这说明百里香醌抑制A431细胞增殖具有剂量和时间依赖性。另一方面，台盼蓝染色显示，经低浓度百里香醌处理后，一些细胞被染成蓝色，随着百里香醌浓度增加蓝色染色细胞萎缩、数量相应增加，呈分散状，观察到不贴壁细胞，这说明百里香醌浓度的增加会导致癌细胞死亡。划痕试验结果显示，24h后，中、高浓度实验组划痕距离大于对照组（0h），说明百里香醌能抑制A431细胞的迁移，且具有剂量依赖性。

细胞凋亡过程不仅受到抗凋亡和促凋亡效应分子的严格调控，如Bcl-2蛋白家族，还可以通过多种途径进行调节[12]。Bcl-2家族包含抑制（Bax）和促进细胞凋亡（Bcl-2）两类功能相反的蛋白质[13]。Bax/Bcl-2的表达比率对于诱导细胞凋亡至关重要，这个比率决定并调节细胞进入凋亡阶段的进程[14]。Bax/Bcl-2比值的增加会刺激细胞色素C（Cyto C）从线粒体释放到细胞质中，细胞质中的Cyto C与Apaf-1结合，激活Caspase-3和PARP[15]。活化的Caspase-3是执行细胞凋亡的关键因子，负责关键细胞蛋白的切割和失活[16]，而PARP是一种促进DNA损伤修复的酶[17]。Western blot检测结果，经不同浓度百里香醌处理后，A431细胞中Bax、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表达逐渐升高，而Bcl-2表达下降。这提示Bax/Bcl-2比值升高，促使释放至胞浆中Cyto C增加，可能与辅助因子Apaf-1结合并在ATP或dATP存在下促使其形成多聚体，进而激活Caspase-3以及PARP蛋白;免疫荧光染色结果显示，Bax和Bcl-2在细胞质中广泛分布，百里香醌处理后Bax和Bcl-2表达分别增加和减少，这进一步证实了百里香醌诱导Bax/Bcl-2比值的增加及细胞凋亡，与Western blot检测结果基本一致。

综上所述，本研究结果表明，百里香醌能抑制A431细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与百里香醌通过激活线粒体途径，上调Bax/Bcl-2，进而促进Caspase-3、Cyto C和PARP在A431细胞中的表达，导致细胞凋亡有关。

[参考文献]

[1]郑志忠，李利，刘玮，等.正确的皮肤清洁与皮肤屏障保护[J].临床皮肤科杂志，2017，46（11）：824-826.

[2]张佳音，钟咪，饶美荣，等.皮肤鳞状细胞癌细胞中BAG-1表达变化对细胞增殖、凋亡的影响及机制[J].山东医药，2018，58（45）：9-12.

[3]Hosseinzadeh H，Parvardeh S.Anticonvulsant effects of thymoquinone， the major  constituent of Nigella sativa seeds， in mice[J].Phytomedicine，2004，11（1）：56-64.

[4]蔡偉，杨佳丹，高珊，等.百里香醌对脂多糖诱导大鼠心肌纤维化的保护作用及机制研究[J].中国药房，2019，30（4）：464-468.

[5]Woo CC，Kumar AP，Sethi G，et al.Thymoquinone： potential cure for inflammatory disorders and cancer[J].Biochem Pharmacol，2012，83（4）：443-451.

[6]涂幸，罗利，刘艺琳，等.葡萄籽原花青素提取物对HT22细胞糖氧剥夺损伤的保护作用[J].神经解剖学杂志，2020， 36（1）：57-64.

[7]魏明，师广勇，刘佳，等.生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响[J].中华皮肤科杂志，2018，51（4）：305-309.

[8]昝雪娟，荣冬芸，潘军玲，等.姜黄挥发油联合顺铂对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖和凋亡的影响及机制[J].中华皮肤科杂志，2018，51（4）：294-298.

[9]王瑞，王菲菲，杨俊亚.手术切除联合液氮冷冻治疗皮肤鳞状细胞癌患者的临床疗效观察[J].中华老年医学杂志，2019，38（12）： 1398-1400.

[10]Masood AK.Thymoquinone， a constituent of prophetic medicine-black seed， is a miracle therapeutic molecule against multiple diseases[J].Int J Health Sci （Qassim），2019，13（1）：1-2.

[11]Zhu WQ，Wang J，Guo XF，et al.Thymoquinone inhibits proliferation in gastric cancer via the STAT3 pathway in vivo and in vitro[J].World J Gastroenterol，2016，22（16）：4149-4159.

[12]王海臻，蔡丹纯，廖丹丹，等.内质网应激介导滋养细胞凋亡在妊娠期肝内胆汁淤积症中的作用及机制[J].南方医科大学学报，2018，38（5）：572-577.

[13]程新燕，符翠莉.芹菜素对大鼠骨肉瘤细胞凋亡及相关蛋白Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9，细胞色素C的影响[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（15）：139-142.

[14]单海军，曹彩红，张英英，等.补肾开窍祛痰方对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马神经元凋亡基因Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比例变化的影响[J].时珍国医国药，2018，29（6）：1336-1338.

[15]孙吉凤，何海涛.黄芩素通过线粒体凋亡途径诱导体外培养喉癌细胞凋亡的机制[J].中国老年学杂志，2018，38（8）：1947-1951.

[16]窦雪娇，陈松，张红.七氟烷经不同途径吹入对体外循环犬肺组织呼吸功能和Caspase-3表达的影响[J].重庆医学，2019，48（6）：917-920.

[17]李玲玲，赵玉霞.PARP-1及其抑制剂与肿瘤发生、发展及放射敏感性关系研究进展[J].中华放射肿瘤学杂志，2017，26（11）：1350-1353.

[收稿日期]2021-01-06

本文引用格式：周曉谦，金星姬，杨竹生，等.百里香醌调控Caspase-3/Bax/Bcl-2信号通路诱导人皮肤鳞状细胞癌增殖和凋亡的作用机制研究[J].中国美容医学，2021，30（6）：114-117，163.