淫羊藿苷对腺嘌呤所致少精子症模型大鼠的治疗作用及机制研究*

庾杰华，郭秀彩，邓英光，贺周扬，张紫萍

（1.广州市第十二人民医院，广东 广州 510620；2.广东嘉博制药有限公司，广东 清远 511500）

不能生育的育龄夫妇中，男性不育者大约占50%，而少、弱精子症是导致男性不育的主要原因之一[1]。世界卫生组织规定，精子数小于2×107/mL为少精子症。近年来，男性不育症呈现不断上升的趋势，但仍缺乏有效的治疗药物。中药具有多靶点、多途径和辨证论治的优点，近年来，中医药在治疗精子质量低下方面具有一定的优势[2]。淫羊藿属于小檗科多年生直立草本植物，是一种传统的补益类中药，具有补肾阳、强筋骨和祛风湿的作用[3]。淫羊藿苷（Icariin，ICA）是淫羊藿的主要有效成分[4]，现代药理研究证明，淫羊藿苷具有提高性功能[5]、促进性腺发育和促进雄激素分泌等作用[6]。本研究拟通过观察淫羊藿苷对大鼠少精子症的治疗作用和可能的作用机制，探索淫羊藿苷对男性不育症的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄雄性SPF级SD大鼠60只，体质量200～230 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002。动物自由摄食和饮水，饮用水为灭菌水，每天更换水瓶，饲养温度22～25℃，湿度为40%～60%。经本单位医学实验动物管理委员会批准，实验后大鼠处死方法：10%水合氯醛溶液，以0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射，大鼠麻醉后，腹主动脉放血处死大鼠。

1.2 药物与试剂淫羊藿苷（上海友思生物技术有限公司，批号：160306，纯度98%）；男宝胶囊（山西康威制药有限责任公司，批号：1601074）；腺嘌呤（美国BIORULER公司，货号：RH31666-25g）；羧甲基纤维素钠（美国BIORULER公司，货号：RH30500-500g）；SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20160311）；MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20160414）；睾酮ELISA试剂盒（武汉优尔生商贸有限公司，批号：L160309171）；尿素氮试剂盒（日本和光纯药工业株式会社，批号：2016228）；肌酐试剂盒（日本和光纯药工业株式会社，批号：2016364）。

1.3 主要仪器MK3型酶标仪（芬兰TECAN GENios公司）；离心机（美国Thermo Fisher公司）；LAbSPECT-003型全自动生化分析仪（日本日立公司）；BX43显微镜（日本OLYMPUS）。

1.4 分组将60只雄性SD大鼠适应性饲养1周，按体质量随机分为正常组、模型组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组、淫羊藿苷高剂量组和男宝胶囊组，每组10只。

1.5 实验给药淫羊藿低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予5、10和20 mg/kg的淫羊藿苷溶液，男宝胶囊组大鼠灌胃给予350 mg/kg的男宝胶囊溶液，正常组及模型组大鼠灌胃等体积去离子水，给药体积均为1 mL/100 g，1次/d，连续给药4周。

1.6 造模在给药的同时造模，每天给药4 h后，除正常组外，其他组大鼠给予250 mg/kg腺嘌呤混悬液进行造模，正常组灌胃等体积的0.5%CMC溶媒，每天给予造模药物1次，连续给药4周。实验结束后，取大鼠附睾，采用血细胞计数板进行精子计数及形态学分析，计算精子密度、活动率和精子畸形率指标，造模组大鼠的精子密度和精子活动率明显低于正常组即为造模成功。

1.7 观察指标

1.7.1 一般状态观察 实验过程中，各组大鼠每周称1次体质量，根据体质量调整给药量，同时密切观察大鼠的一般行为及状态。

1.7.2 精子密度和精子畸形率 实验结束后，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血后，放血处死大鼠，取大鼠附睾，PBS洗净，眼科剪剪碎，加PBS至2 mL的体积后混匀，37℃水浴加热5 min，取上清液涂片，显微镜下观察100个精子，计数活动精子数，计算精子活动率，精子活动率=活动精子数/100×100%。37℃水浴加热20 min后，取上清液，采用血细胞计数板在显微镜下进行精子计数及形态学分析，计算精子密度，精子密度=（N×5×10×稀释倍数）/mL，N为5个中方格的精子总数。

1.7.3 性器官指数 分离睾丸和附睾后，采用电子天平称量质量，计算脏器指数，脏器指数=脏器质量（g）/体质量（g）×100。

1.7.4 肾功能 腹主动脉采血后，1 000 r/min离心10 min，分离取血清，采用全自动生化仪测定血清尿素氮、肌酐含量。

1.7.5 血清睾酮含量 腹主动脉采血后，1000r/min离心10min，分离取血清，采用试剂盒检测血清睾酮含量。

1.7.6 睾丸组织中SOD和MDA腹主动脉放血处死大鼠后，取同一侧睾丸组织，用生理盐水在冰浴下匀浆，采用试剂盒检测组织匀浆中的SOD活性和MDA的含量。

1.8 统计学方法采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学处理，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，重复测量数据采用重复测量方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般状态观察及体质量变化正常组大鼠在整个实验过程中状态良好，毛发正常；与正常组比较，模型组大鼠造模1周后，逐渐出现尿量增多，进食量减少，反应迟钝，体毛稀疏等症状；男宝胶囊组和淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠治疗后状态逐渐好转，尿量恢复正常。

给药前各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。给药后1周，与正常组比较，模型组、男宝胶囊组和淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠体质量有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠体质量整体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应，与正常组比较，模型组、男宝胶囊组和淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠的体质量明显降低（P＜0.01），但男宝胶囊组和淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠体质量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠在给药前后的各时间点体质量比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在时间效应；时间因素与分组因素存在交互效应（P＜0.05）。（见表1）分组与时间交互效应轮廓图见图1。

表1 各组大鼠大鼠体质量比较（±s）

表1 各组大鼠大鼠体质量比较（±s）

注：F时间主效应=888.238，P时间主效应=0.000；F分组主效应=7.516，P分组主效应=0.000；F交互效应=112.154；P交互效应=0.000；与正常组比较，aP＜0.01

组别 动物数（只） 给药剂量（mg/kg） 给药前 给药后1周 给药后4周 F P正常组 10 - 251.20±11.63 301.60±24.07 410.20±29.56 124.667 0.000模型组 10 - 258.20±15.52 283.00±17.65 295.10±23.20a 9.732 0.001淫羊藿苷低剂量组 10 5 254.20±14.07 277.90±20.84 286.90±24.95a 6.824 0.004淫羊藿苷中剂量组 10 10 254.20±13.07 280.80±32.07 294.00±20.76a 7.561 0.002淫羊藿苷高剂量组 10 20 256.70±20.21 275.80±26.11 286.30±27.83a 3.701 0.038男宝胶囊组 10 350 254.40±14.63 276.10±21.71 301.20±35.81a 8.347 0.002 F 0.245 1.625 30.935 P 0.941 0.169 0.000

图1 体质量组别与时间交互效应轮廓图

2.2 各组大鼠精子密度和精子活动率比较与正常组比较，模型组大鼠精子密度和精子活动率均明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，男宝胶囊组和淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠精子密度和精子活动率均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；与男宝胶囊组比较，淫羊藿苷低、中剂量组大鼠精子密度和精子活动率均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；淫羊藿苷高剂量组大鼠精子密度和精子活动率与男宝胶囊组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠精子密度和精子活动率比较（±s）

表2 各组大鼠精子密度和精子活动率比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与男宝胶囊组比较，dP＜0.05，eP＜0.01

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg） 精子密度（106/mL） 精子活动率（%）正常组 10 - 60.24±11.32 80.27±12.56模型组 10 - 32.45±7.56a 34.81±6.24a淫羊藿苷低剂量组10 5 41.63±14.31be 42.27±9.30be淫羊藿苷中剂量组10 10 46.87±12.57cd 52.36±13.41cd淫羊藿苷高剂量组10 20 54.21±15.04c 62.64±7.86c男宝胶囊组 10 350 51.34±12.13c 58.26±9.12c

2.3 各组大鼠性器官指数比较与正常组比较，模型组大鼠睾丸指数和附睾指数有降低的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，男宝胶囊组和淫羊藿苷中、高剂量组大鼠睾丸指数和附睾指数均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；与男宝胶囊组比较，淫羊藿苷低、中剂量组大鼠睾丸指数和附睾指数均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；淫羊藿苷高剂量组大鼠睾丸指数和附睾指数与男宝胶囊组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠性器官指数比较（±s）

表3 各组大鼠性器官指数比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与男宝胶囊组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别 动物数（只） 给药剂量（mg/kg） 睾丸指数 附睾指数正常组 10 - 0.37±0.05 0.145±0.02模型组 10 - 0.35±0.04 0.130±0.02淫羊藿苷低剂量组10 5 0.38±0.04d 0.142±0.03d淫羊藿苷中剂量组10 10 0.40±0.05b c 0.156±0.03a c淫羊藿苷高剂量组10 20 0.44±0.05b 0.158±0.03b男宝胶囊组 10 350 0.45±0.03b 0.163±0.02b

2.4 各组大鼠肾功能比较与正常组比较，模型组大鼠肾功能减退非常明显，肌酐和尿素氮两项指标均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，男宝胶囊组和淫羊藿苷中、高剂量组大鼠肌酐和尿素氮水平均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；与男宝胶囊组比较，淫羊藿苷低、中剂量组大鼠肌酐均明显升高（P＜0.05），淫羊藿苷低剂量组大鼠尿毒氮明显升高（P＜0.05），淫羊藿苷中剂量组大鼠尿毒氮明显降低（P＜0.05）；淫羊藿苷高剂量组大鼠肌酐和尿素氮水平与男宝胶囊组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠肾功能比较（±s）

表4 各组大鼠肾功能比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与男宝胶囊组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只） 剂量（mg/kg）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）正常组 10 - 5.74±0.67 24.12±3.25模型组 10 - 61.25±12.36c 260.23±65.48a淫羊藿苷低剂量组10 5 56.28±13.65d 240.10±57.50b d淫羊藿苷中剂量组10 10 42.61±10.87c d 220.72±60.17c d淫羊藿苷高剂量组10 20 36.53±9.04c d 185.64±51.83c男宝胶囊组 10 350 45.20±8.86c 190.32±48.26c

2.5 各组大鼠血清睾酮含量比较与正常组比较，模型组大鼠血清睾酮含量明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，男宝胶囊组和淫羊藿苷低、中、高剂量组大鼠血清睾酮含量均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；与男宝胶囊组比较，淫羊藿苷低、中剂量组大鼠血清中睾酮含量均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；淫羊藿苷高剂量组大鼠血清中睾酮含量与男宝胶囊组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表5）

表5 各组大鼠血清睾酮含量比较（±s）

表5 各组大鼠血清睾酮含量比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与男宝胶囊组比较，dP＜0.05，eP＜0.01

组别 动物数（只） 给药剂量（mg/kg） 睾酮（ng/mL）正常组 10 - 0.84±0.22模型组 10 - 0.37±0.13a淫羊藿苷低剂量组10 5 0.45±0.16b e淫羊藿苷中剂量组10 10 0.63±0.24c d淫羊藿苷高剂量组10 20 0.86±0.34c男宝胶囊组 10 350 0.75±0.29c

2.6 各组大鼠睾丸组织中SOD活性和MDA含量比较与正常组比较，模型组大鼠睾丸组织中SOD活性明显降低（P＜0.01），而MDA含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，男宝胶囊组和淫羊藿苷中、高剂量组大鼠睾丸组织中SOD活性均明显升高（P＜0.01），MDA含量均明显降低（P＜0.01）；与男宝胶囊组比较，淫羊藿苷剂低量组大鼠睾丸组织中SOD活性明显降低（P＜0.05），MDA含量明显升高（P＜0.05）；淫羊藿苷中剂量组大鼠睾丸组织中SOD活性和MDA含量与男宝胶囊组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；淫羊藿苷高剂量组大鼠睾丸组织中MDA含量明显低于男宝胶囊组（P＜0.05），但SOD活性与男宝胶囊组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表6）

表6 各组大鼠睾丸组织中SOD活性和MDA含量比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与男宝胶囊组比较，dP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）SOD（U/g）MDA（nmol/mg）正常组 10 - 120.35±31.41 3.54±0.68模型组 10 - 62.60±24.10a 7.87±1.25a淫羊藿苷低剂量组10 5 70.18±25.35d 6.13±0.87d淫羊藿苷中剂量组10 10 85.24±32.62c 5.21±0.92c淫羊藿苷高剂量组10 20 93.36±36.58c 4.23±0.36c d男宝胶囊组 10 350 89.27±26.28c 5.62±0.45c

3 讨 论

淫羊藿又名仙灵脾，最早记载于《神农本草经》，具有“益精气，坚筋骨，补腰膝”的功效[7]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分之一，目前已经有较多文献报道了其对生殖系统具有广泛的药理作用[5-6]，但尚无淫羊藿苷对少精子症影响的相关研究报道。因此，本研究以腺嘌呤制备少精子症大鼠模型，研究了淫羊藿苷对少精子症大鼠的治疗作用及可能的机制。

腺嘌呤是制作慢性肾脏功能衰竭动物模型的常用试剂[8]，但研究发现它可通过诱发肝肾功能损害，造成雄性大鼠睾丸生成精子的功能障碍。目前，腺嘌呤诱导的少精子症大鼠模型是少精子型不育症药效学研究的常用模型之一[9]。男宝胶囊临床用于补肾壮阳，文献报道其对少精子症模型大鼠的生殖功能具有良好的保护作用[10]，故本研究采用男宝胶囊为阳性对照药。

有研究表明，采用腺嘌呤造模后，大鼠睾丸中的精子数量明显减少，精子活动率明显降低，血清中睾酮表达水平降低[11]。本研究中，250 mg/kg腺嘌呤给药4周后，模型组大鼠精子密度和精子活动率均明显低于正常组，血清中睾酮含量也明显降低，与文献报道相符，说明少精子症模型造模成功。本实验中，淫羊藿苷干预后大鼠精子密度、精子活动率、性器官指数及血清睾酮含量均升高。另外，还发现淫羊藿苷对肾脏功能指标有明显的改善作用，结果表明淫羊藿苷对少精子症模型大鼠具有良好的治疗作用。

男性发生精子异常的发病机制之一，就是抑制机体抗氧化酶的活性或者增加活性氧自由基（ROS）的水平[12]，产生氧化应激状态。过量的ROS会破坏精子核内DNA的完整性和线粒体的结构和功能，促进生殖细胞的凋亡，进而影响受精率。抗氧化剂应用于少精子症的主要作用就是减少ROS对精子的刺激作用，减少氧化应激造成的睾丸损伤[13]。目前，已有文献报道，淫羊藿苷是一种抗氧化剂，具有较强的抗氧化作用[14-15]。本研究中，腺嘌呤诱导的少精子症大鼠睾丸组织中的SOD活性降低，而MDA含量升高，表明腺嘌呤造模后导致大鼠睾丸组织中抗氧化成分减少，产生氧化应激，这与文献报道的情况一致。少精子症大鼠经淫羊藿苷治疗后，大鼠睾丸组织中的SOD活性升高，而MDA含量降低，表明淫羊藿苷可能通过减轻少精子症模型大鼠睾丸组织中的氧化应激状态从而产生生殖保护作用。

综上所述，淫羊藿苷对少精子症大鼠具有良好的治疗作用，其机制可能与改善睾丸组织中的氧化应激水平有关。