基于网络药理学和分子对接探究浙贝母治疗急性髓系白血病的作用机制

白鹿原，安兰花，王 悬，王晨琳，尹 一，王祥麒

（1.河南中医药大学针灸推拿学院，河南 郑州 450008；2.河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450008；3.河南中医药大学第一临床医学院，河南 郑州 450008；4.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008）

急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）约占成人白血病的70%，病情发展迅速，自然病程仅数月。目前主要有支持治疗、联合化疗、小分子靶向治疗、新型细胞毒性药物治疗、免疫靶向治疗、造血干细胞移植等治疗方法[1-2]。通过上述治疗手段，AML已取得一定治疗效果，5年生存率达50%，但AML的高度异质性和复杂性导致治疗后易复发，预后差，同时造血干细胞移植高昂的费用和配型的困难性也使该疗法难以推广[3-4]。因此研发新型疗效好、价格低廉的治疗AML药物成为目前药物研发的热点，中药具有价格低廉、副作用低、药效作用明显等多项优势，成为当前药物研发的新方向。

浙贝母为百合科植物浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鳞茎，又称大贝、珠贝、元宝贝，为浙江道地药材，是中药处方中常用药物。近年来，通过对浙贝母化学分析发现，浙贝母中主要含有生物碱、多糖和总皂苷等成分，药用价值极高。药理研究显示，浙贝母具有镇咳祛痰、镇痛抗菌、抗溃疡、抗炎止泻、抗肿瘤等作用[5-6]。胡凯文等[7]通过90例白血病病例临床对照试验证实，浙贝母可明显提高化疗效果，尤其对难治、复发白血病疗效显著。浙贝母化学成分复杂，作用靶点众多，现代研究对于浙贝母治疗急性髓系白血病的作用机制仍不清楚。本研究运用网络药理学方法预测浙贝母治疗AML的作用靶点，并进行富集分析，构建“化学成分-靶点-通路”网络，通过GEO数据库、分子对接技术初步验证，探讨作用机制，为下一步的动物体内外药理试验提供了方向，同时为今后的临床推广应用及新药研发提供依据。

1 方 法

1.1 浙贝母化学成分的筛选 通过中医药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）检索浙贝母的化学成分，根据毒药物动力学（ADME）以口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为标准，对浙贝母化学成分进行筛选，同时结合文献报道，对浙贝母化学成分进行补充。

1.2 浙贝母化学成分靶点的预测和筛选 使用TCMSP检索浙贝母中化学成分相关靶点基因，并通过Uniprot蛋白质数据库将预测的靶点基因标准化。同时通过有机小分子数据库PubChem检索浙贝母化学成分的3D结构，将其3D结构导入Swiss Target Prediction数据库，预测化学成分靶点信息，剔除可能性（Probability）为0的基因后汇总剔重，可得到Swiss Target Prediction数据库预测基因。将2个数据库预测的靶点基因进行合并，剔重，即得到浙贝母化学成分靶点基因。

1.3 急性髓系白血病靶点的获取

1.3.1 疾病数据库中急性髓系白血病靶点的筛选 以“acute myelogenous leukemia”为关键词，通过OMIM数据库、GeneCards数据库，检索AML的潜在靶点，再通过DRUGBANK数据库寻找AML一线临床药物靶点进行补充。将3个数据库得到的靶点基因通过Uniprot标准化后合并剔重，即得到AML靶点基因。

1.3.2 GEO数据库急性髓系白血病差异基因的筛选 以“acute myelogenous leukemia”为关键词，检索GENE EXPRESSION OMNIBUS数据库，查找正常人群与AML患者的骨髓高通量测序数据集。通过R软件进行分析筛选并进行可视化处理。

1.4 浙贝母化学成分-急性髓系白血病靶点PPI网络的构建 为进一步探究浙贝母化学成分同AML的作用关系，通过Venny2.1.0取两者交集基因并绘制韦恩图，交集基因即为浙贝母作用AML的靶点基因。将其提交至STRING数据库，设定物种为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设定为“medium confidence(0.4)”，余默认设置不变，构建蛋白质相互作用网络（PPI）。将PPI数据导入至CytoScape3.7.2软件，使用“Network analyzer”功能，对PPI网络进行拓扑分析，筛选浙贝母作用AML的核心靶点基因。

1.5 基因功能与通路富集分析 将浙贝母作用AML的靶点基因导入至DAVID Bioinformatics Resources 6.8，设定物种为“Homo sapiens”，提交后即得到靶点基因的GO注释分析和KEGG通路分析结果。后运用统计学的方法，设置P≤0.05，对富集分析结果进行筛选。将筛选的结果导入R软件，通过“ggplot2”包对排名靠前的数据进行可视化处理。

1.6 浙贝母化学成分-靶点-通路网络图的构建 运用CytoScape3.7.2软件构建化学成分-靶点-通路网络图，并对网络图进行拓扑分析，计算浙贝母主要化学成分网络节点特征参数。

1.7 GEO差异基因验证 检索GEO数据库，确定相应数据集，筛选出AML的差异基因，此为经过临床验证的AML差异基因，为探求浙贝母与AML之间作用关系，分析浙贝母靶点基因与AML差异基因是否存在交集基因。

1.8 分子对接验证 为验证浙贝母化合物对AML相关基因的作用效果，采取分子对接的方法初步验证。选取“1.4”项中所得的核心靶点基因，取度值排名靠前的基因，结合“1.7”项中所取得的交集基因，取两者并集。后通过PDB（http://www.rcsb.org/）数据库，结合蛋白种属、分辨率、是否含有共晶配体、活性口袋是否完整等限定条件，对同种基因蛋白的不同晶体结构进行筛选，下载匹配度较高的蛋白晶体结构文件，通过MOE软件中dock功能与浙贝母化学成分进行分子对接，根据其对接评分S评估浙贝母化学成分同作用靶点的结合稳定性，从而评价浙贝母对AML的作用效果。

2 结 果

2.1 浙贝母化学成分的筛选 通过TCMSP检索出浙贝母化学成分17种，经ADME筛选后获得浙贝母化学成分7种。再通过对相关文献的挖掘[8]，补充一些OB、DL值较低，但经药理学研究，对人体仍有药理活性的成分，如浙贝母甲素、浙贝母乙素。最终筛选出浙贝母化学成分9种。（见表1）

表1 浙贝母主要化学成分基本信息

2.2 浙贝母化学成分靶点的筛选 通过TCMSP化合物靶点预测功能，检索出靶点72个，剔重后获得51个潜在靶点。通过Swiss Target Prediction平台靶点预测功能，预测出相关化学成分靶点信息后，剔除可能性（Probability）为0的基因后汇总剔重，获得370个潜在靶点基因。将2个数据库预测的靶点基因进行合并后再次剔重，即得到浙贝母化学成分靶点基因397个。

2.3 急性髓系白血病靶点基因的获取

2.3.1 疾病数据库中急性髓系白血病靶点的筛选 通过GeneCards数据库检索与AML相关靶点基因2 405个，为获得与AML密切程度较高基因，根据经验筛取Relevance score≥10的靶点基因为AML潜在靶点，筛选后获得785个靶点基因。再检索OMIM数据库、DRUGBANK数据库，依次将3个数据库得到的靶点基因通过Uniprot标准化，最后将3个数据库靶点基因汇总剔重，即得到AML相关靶点基因892个。

2.3.2 GEO中急性髓系白血病差异基因的筛选 通过对GEO数据库的检索，确定GSE84881数据集[9]，该芯片数据集收集了4个正常骨髓间充质干细胞样本和19个AML患者骨髓间充质干细胞样本的基因表达谱。后使用R软件下载并分析GSE84881原始数据，以P≤0.05且log2FC绝对值≥1为条件进行差异分析后获得206个差异表达基因，此为急性髓系白血病差异基因。选取log2FC绝对值≥2的基因通过TBtools[10]软件绘制聚类热图，同时将原始数据绘制火山图。（见图1）

图1 AML相关芯片差异基因聚类热图和火山图

2.4 浙贝母化学成分-急性髓系白血病PPI网络的构建 将浙贝母化学成分相关靶点基因与AML靶点基因通过Venny2.1.0取交集并绘制韦恩图。（见图2）将所得的97个交集基因提交至STRING数据库，分析PPI网络。后将PPI数据导入至CytoScape3.7.2软件，通过拓扑分析，进而绘制出PPI网络图。（见图3）依据相关拓扑参数对浙贝母作用于AML的基因进行筛选，取连接度值（degree）≥2倍中位数的基因为核心靶点基因，共15个。（见表2）

表2 浙贝母作用于AML的核心靶点基因及其节点网络参数

图2 浙贝母-急性髓系白血病靶点基因韦恩图

图3 浙贝母作用于AML靶点基因的PPI网络

2.5 基因功能与通路富集分析 通过DAVID数据库对浙贝母作用于AML的靶点基因进行富集分析，分析结果包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）、KEGG等4个部分，设置P≤0.05对分析结果进行筛选，分别得到348、84、49条生物功能信息，96条信号通路信息，并通过R软件中“ggplot2”包对排名较前的结果进行可视化处理。（见图4）生物过程中主要涉及细胞的增殖、细胞的凋亡、细胞迁移、血小板活化、MAP激酶活性的正调控；分子功能中主要涉及酶、大分子蛋白质的结合，部分酶活性的调节；细胞组分主要包括细胞核、细胞质、核质、细胞表面、线粒体、蛋白质复合物、核染色质等，浙贝母对AML的作用可能与以上这些功能过程相关。在KEGG信号通路方面，通过对排序较前的30条信号通路研究发现，主要为细胞凋亡、细胞增殖、代谢、免疫调节、促血管生长等通路。（见图4）

图4 浙贝母作用于AML靶点基因的富集分析

2.6 浙贝母化学成分-靶点-通路网络图的构建 通过CytoScape3.7.2软件构建浙贝母化学成分-靶点-通路网络图，并分析浙贝母主要化学成分的网络节点特征参数。此网络图包括9个浙贝母化合物节点，97个作用靶点节点，15个通路节点及478条相互关系连线。每个化合物平均与21个靶点相互作用，每个信号通路平均有19.8个相关靶点参与调控，这说明了浙贝母可通过多成分、多靶点协同作用于多个通路来发挥其对AML的治疗作用。（见图5、表3）

图5 浙贝母化学成分-靶点-通路网络图

表3 浙贝母主要化学成分网络节点特征参数

2.7 GEO差异基因验证GEO数据库是储存芯片、二代测序及其他高通量测序数据的数据库，我们可通过该数据库检索到任何物种的基因表达数据。GEO上有4类数据GSM、GSE、GDS、GPL。GSE数据为一个试验项目的多个芯片试验，通过“2.3.2”项中确定GSE84881数据集，该数据集包括4个正常样本，19个AML样本，运用R软件筛选获得206个AML差异基因。将AML差异基因与浙贝母化学成分靶点基因提交至Venny2.1.0取得交集基因，交集基因为CTSC、CYP1B1、DAPK1、LGALS3、PTGS2。该结果不但验证了浙贝母对AML确有调节作用，也侧面说明这5个基因也为浙贝母作用于AML的靶点基因。

2.8 分子对接验证 分子对接是一种较为成熟的计算机辅助药物设计方法，其原理基于锁钥模型，通过计算机模拟计算配体与受体在空间结构、静电作用、范德华力作用、氢键等各方面是否互补匹配，进而评估配体与受体能否结合及结合效果[11]。选取5个“2.7”项中获得的AML差异基因和度值排名靠前的6个浙贝母作用于AML核心靶点基因，于PDB数据库下载蛋白晶体结构PDB文件，后使用MOE软件与浙贝母中的9个主要化学成分分别进行对接，对接结果见图6。根据MOE软件打分函数London dG计算，对接评分S值越低，配体与受体结合越稳定，对接效果越好。分子对接结果显示所有化合物平均对接评分为-5.83，所有对接结果中，6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1，4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖与CYP1B1结合效果最好，评分为-10.1，分子对接3D模式及2D模式见图7。CYP1B1为浙贝母结合效果最好的靶点蛋白，平均对接评分为-8.5。

图6 分子对接结果

图7 分子对接模式图

3 讨 论

急性髓系白血病（AML）是造血祖细胞变异引起的恶性克隆性疾病，中医典籍对此病没有明确记载，《圣济总录》热劳篇有云：“论曰热劳之证，心神烦躁，面赤头疼，眼涩唇焦，身体壮热，烦渴不止，口舌生疮，食饮无味，肢节酸疼，多卧少起，或时盗汗，日渐羸瘦者是也。”这段症状描述与AML发热、感染、出血、乏力、久病后身体消瘦等症状十分相似。根据AML临床症状及发病特点，可归为“虚劳”“血证”“瘀积”“痰核”等范畴。

在长期临床实践中发现，AML进展过程中多见痰核、瘰疬、瘀斑、瘀点、发热等临床表现，多与痰、瘀、热等病理因素密切相关。清代高锦庭曾言：“癌病者，非阴阳之气郁结肿，乃五脏瘀血，浊气痰凝而成。”正气亏虚，以致气血虚弱，津聚液停汇聚为痰，痰阻则气滞，气机阻滞以致血行不利，日久形成血瘀，痰与瘀相互交织形成痰瘀互结，此为AML发病关键病机，在此疾病发展过程中，痰邪为致病关键因素[12-13]。基于对AML致病因素的判断，其治法当选化痰散结，浙贝母为苦寒之药，功擅化痰止咳，清热散结，又可治瘰疬瘿瘤、疮痈肿毒之病，当为首选之药。在临床实践中，宋娜莎等[14]通过200例难治性急性白血病患者随机对照试验证实复方浙贝母颗粒能够诱导肿瘤细胞死亡，降低机体耐药力，增强机体对化疗药物的吸收，增强化疗效果。李冬云等[15]通过多中心随机临床对照试验证实浙贝母颗粒辅助化疗能够提高难治性急性白血病围化疗期临床疗效，以上多个临床试验证实浙贝母治疗AML具有显著疗效。

本课题组通过网络药理学的方法筛选出浙贝母中主要化学成分，并进行对接验证，在度值排名靠前的几个化合物中，6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖、紫鄂贝碱、β-谷甾醇、浙贝母甲素、浙贝母乙素对接效果较好。相关基础研究结果显示浙贝母甲素、浙贝母乙素为浙贝母中主要的生物碱，具有逆转肿瘤细胞多药耐药（MDR）的作用，而且能逆转两种不同机制的肿瘤细胞MDR耐药性[16-17]。β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，是动植物细胞膜的主要组成成分，具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种药理活性[18]。紫鄂贝碱与6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷均为浙贝母中化学成分，与较多AML靶点基因有作用关系，分子对接验证显示与对接靶点蛋白均有较好的结合稳定性，因此推测这两个化合物对AML有较好的治疗效果，但目前暂未发现相关研究，本课题组接下来将进一步研究其治疗AML的作用机制。

分子对接结果显示，浙贝母主要化学成分与CYP1B1、GAPDH、PTGS2、CCND1靶点基因有较好的结合效果，这些靶点基因主要涉及细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、代谢、免疫调节等方面，为浙贝母作用的核心靶点。CYP1B1属于细胞色素酶基因家族，表达的酶与人体内药物代谢、激素代谢的调控相关。GAPDH为糖代谢过程中的关键酶，对ATP生成起关键作用，有关研究发现，GAPDH在能量代谢、细胞凋亡与肿瘤发生、DNA修复等方面发挥重要作用[19]。PTGS2（COX-2）可以促进细胞数目增加，减缓细胞凋亡速度，加速新生血管的生成。CCND1基因编码的cyclin D1是细胞周期蛋白家族中一员，可促进细胞的增殖。同时CCND1也是PI3K/AKT信号通路的重要基因，该信号通路激活后，促进细胞增殖，从而使AML细胞对药物的敏感性下降，影响治疗效果[20-21]。

DAVID数据库对浙贝母作用于AML的靶点基因富集分析结果显示，涉及的通路多集中在细胞凋亡、细胞增殖、代谢、免疫调节、促血管生长等方面。在细胞增殖、凋亡方面，PI3K/AKT在白血病细胞发挥着重要作用，活化可促进白血病细胞增殖并抑制其凋亡，其作用通过调节各种生理状态下的线粒体来实现。线粒体受外界刺激引发膜通透性改变，激活Caspase-9、Caspase-3引起细胞凋亡[22-24]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路是人血管发生和血管生成过程的关键通路，其生成物VEGF可作用于内皮细胞的糖基化细胞的有丝分裂素，从而促进肿瘤细胞的血管生成[25]。白血病细胞的生长必须依赖新生血管生成来提供足够的营养物质，从而使自身不断增殖扩张，因此血管新生对于AML意义重大。在AML患者病变组织内均存在VEGF过度表达情况，VEGF不断促进内皮细胞分裂增殖，产生大量新生血管，对AML细胞生长转移发挥协同作用。同时研究发现AML细胞自分泌的VEGF因子对正常骨髓造血细胞的生长增殖会起到抑制作用，对自身生长增殖起促进作用[26-28]。

分子对接验证结果显示，浙贝母中主要化合物6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖与CYP1B1结合稳定性最高。CYP1B1属于细胞色素P450超家族中CYP1家族，参与大量外源性化学物质和某些内源性物质的代谢，LOPES B A[29]研究结果显示CYP1B1基因中rs1056836位点的GG基因型与降低AML的风险密切相关。CYP1B1酶为在肿瘤组织中高表达的药物代谢酶，可以在3个不同的水平发挥作用：诱变性4-羟基雌二醇的形成；前致癌物的生物活化；肿瘤耐药性。由于其特殊的生理功能，细胞色素CYP1B1是一种很有前途的生物标志物和治疗靶点[30-31]。6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖通过对CYP1B1靶点调节发挥治疗AML的作用，考虑其可作为新型CYP1B1酶抑制剂，本课题组将进一步研究其作用效果。

综合分析，本研究运用网络药理学和分子对接的方法，联合GEO数据库，对浙贝母作用于AML的主要化学成分、核心靶点、主要作用通路进行了分析，揭示了浙贝母治疗AML的作用机制，后续本课题组拟根据分子对接结果设计动物体内外药理试验，对6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖通过对CYP1B1靶点的调节治疗AML的机制进行深入研究，为临床应用及新药研发提供更多参考。