复合维生素B 对生长期山羊后段肠道菌群组成及肠黏膜的影响

2021-11-22吴晨姚志浩梅文晴冯宇妍陈渠倪迎冬

草业学报 2021年11期

吴晨，姚志浩，梅文晴，冯宇妍，陈渠，倪迎冬

（南京农业大学动物医学院，农业农村部动物生理生化重点实验室，江苏南京210095）

B 族维生素属于水溶性维生素，对体内物质代谢和健康发挥着重要作用。VB 作为饲料添加剂被广泛用于提升动物的生长性能和产品品质。早期研究表明，不同于单胃动物，反刍动物瘤胃内存在某些微生物能够合成B 族维生素，因此无须从饲料日粮中额外补充VB［1］。然而，近年来的研究发现，随着反刍动物集约化养殖程度的提高，以及幼龄反刍动物瘤胃功能发育不全，适量补充B 族维生素对反刍动物健康和生产性能的提升具有重要意义。

动物胃肠道存在一个极其庞大且复杂的微生物群落，包含大约1014个细菌，分属于500～1000 个物种［2］。研究资料显示，肠道菌群与宿主新陈代谢状态及饮食成分密切相关［3−4］，并参与组成肠道上皮屏障，保护肠道免受病原菌、毒素等的侵害［5］。因此，健康的肠道“微生态系统”对于维持机体健康至关重要。研究表明，添加维生素B1和B12可显著改变5～15 周龄五龙鹅肠道的菌群丰度，增加有益菌丰度并促进肠道发育［6−7］。由于小肠上皮细胞更新较快，严重缺乏叶酸和维生素B12时导致小肠绒毛缩短和有丝分裂减少，其机制与VB 促进黏膜细胞蛋白合成、维持绒毛和黏膜的完整性有关［8］。与单胃动物一样，反刍动物肠道微生态平衡是其健康和良好生产性能的前提，而反刍动物拥有更丰富的肠道微生物。有研究表明，山羊结肠和盲肠主要菌群相似，优势菌群主要包括厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门［9］。Jiang 等［10］发现不同品种山羊肠道菌群丰度亦相似，食物结构与组成是影响肠道菌群的主要因素之一。此外，饲料添加剂、断奶时间、生殖过程等均会影响牛肠道菌群的丰度［11］。反刍动物后段肠道菌群对饲料中纤维素和半纤维素的降解可高达30%［12］。除了消化功能，肠道微生物与宿主细胞互作，促进新生反刍动物肠道免疫系统的发育，形成第一道机体免疫屏障−黏膜免疫屏障［13］。

目前，对反刍动物微生物的研究主要集中于瘤胃微生物组成与功能上［14−15］，对肠道微生物区系的研究较少。早期研究表明，由于幼龄反刍动物瘤胃功能发育不全，需在日粮中补充维生素B1［16］，并且VB 作为一种饲料添加剂对机体代谢的影响可能与肠道微生物的改变有关［11，17］。因此，我们推测日粮中添加复合VB 对生长期山羊的生长性能具有积极作用，且可能是通过改善其肠道菌群稳态和黏膜屏障结构来实现的。然而，目前相关研究资料鲜有报道。本研究以4 月龄波杂山羊为研究对象，探讨日粮添加复合维生素B 对生长期山羊肠道微生物组成、肠道形态结构及肠黏膜屏障功能的影响，为反刍动物养殖提供参考资料。

1 材料与方法

1. 1 试验动物与日粮

选取10 只体重相近［（12. 60±1. 28）kg］、健康状况良好的4 月龄波杂（波尔山羊与本地山羊杂交品种）雌山羊为试验动物，随机分为2 组，每组5 只。对照组（control，CON）采食基础日粮；处理组（vitamin B complex group，VB）在基础日粮中添加复合维生素B（购自河北一兽药业有限公司）。复合维生素B 添加量参照前期的研究资料［18］，其组成及日粮中的添加剂量如下：12 mg·kg−1维生素B1，24 mg·kg−1维生素B2，24 mg·kg−1维生素B3，24 mg·kg−1维生素B5，12 mg·kg−1维生素B6和80 μg·kg−1维生素B12。

试验用饲料购自南京青龙山饲料营销部。精料参照4% 羊生长期复合预混合饲料（购自北京和牧同兴农牧科技有限公司）推荐配方配置。基础日粮参考肉羊饲养标准（NYT816-2004）配置，精料和粗料比例为40∶60，完全满足试验羊营养需求。对照组和VB 组羊饲料仅VB 含量差异，其他成分相同。日粮组成及营养成分见表1。

表1 日粮组成及营养水平Table 1 Dietary composition and nutrient levels

1. 2 动物饲养管理

本试验于2019 年7 月4 日−10 月3 日在南京农业大学动物实验中心进行。试验前对羊舍全面清扫消毒，试验期每周对圈舍进行清扫、定期消毒，确保试验期间羊舍环境卫生。

预饲期为2 周，试验期为11 周，试验羊自由采食饮水，每日于8：00 和16：00 各饲喂1 次。每周称重，记录采食量并计算平均日采食量。试验第1 周时，对照组和VB 组山羊平均日采食量分别为（502. 75±18. 50）g 和（520. 00±18. 33）g；试验第11 周时，两组采食量分别为（773. 00±32. 34）g 和（871. 5±15. 73）g。在1～56 d 试验期间，两组间干物质平均日采食量无明显差异，试验第10 周时VB 组山羊平均日采食量显著高于对照组。

1. 3 样品采集

试验结束，禁食一夜后进行屠宰采样。收集近端结肠和盲肠内容物，−20 ℃保存留待微生物区系和生理参数的检测；同时采集结肠和盲肠上皮组织样品，留待基因和蛋白检测；采集肠道组织样，固定在4% 多聚甲醛中用于组织形态学分析。分子样采集后立即置于液氮中，采样结束后于−80 ℃保存。

1. 4 测定指标

1. 4. 1 16S rRNA 高通量测序采用CTAB 或SDS 方法［19−20］提取样本的基因组DNA，随后通过PCR 扩增和产物混样纯化后，使用Ion S5TMXL 进行上机测序。将得到的原始数据（raw reads）进行拼接过滤得到最终的有效数据（clean reads）。使用Uparse 软件［21］以97% 的一致性将所有样本的有效数据聚类成为OTUs（operational taxonomic units），用Mothur 方法与SILVA132 的SSUrRNA 数据库进行物种注释分析［22］，获得分类学信息并分别在各个分类水平统计群落组成。使用MUSCLE 软件［23］进行多序列比对，得到所有OTUs 序列的系统发生关系。最后以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理。

1. 4. 2 HE 染色与形态结构测定将4% 多聚甲醛固定的肠道组织样品，进行乙醇脱水，石蜡包埋，制成HE 染色切片。光学显微镜下观察组织形态并拍照。空肠和回肠HE 切片每组5 个样本，每张切片随机选取6 个视野，采用Image Pro Plus 6. 0 测量每个视野内绒毛高度和隐窝深度并计算其比值。

1. 4. 3 肠道相关基因测定使用TRIzol（Invitrogen，美国）提取盲肠和结肠黏膜上皮组织中总RNA，实时荧光定量PCR（real-time PCR）扩增反应检测肠道相关基因mRNA 的表达。PCR 的反应条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 个循环。数据采用2−ΔΔCt法分析，因GAPDH基因表达量比较稳定，选作为内参基因。引物由北京擎科生物工程有限公司合成，引物序列信息见表2。

表2 实时荧光定量PCR 引物序列Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR primer sequences

1. 4. 4 肠道相关蛋白测定采用Western blot方法检测肠道相关蛋白，提取盲肠和结肠黏膜上皮组织中总蛋白，统一浓度后95 ℃变性处理，随后进行SDS−PAGE 胶电泳，结束后用NC 膜转印90 min，再用5% 脱脂奶粉封闭2 h 后一抗摇床孵育过夜，第2 天TBST 清洗3 次，加二抗摇床孵育2 h，TBST 清洗3 次，最后进行发光图像采集，采用Im⁃ageJ 统计蛋白灰度值。

1. 5 统计分析

试验数据经Excel 初步整理后，采用SPSS 20. 0 统计软件进行T 检验分析，结果用平均值±标准误（mean±SEM）表示，P<0. 05 表示差异显著，P<0. 01 表示差异极显著，0. 05

2 结果与分析

2. 1 山羊盲肠和结肠内容物微生物α 多样性分析

如图1 所示，稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种（OTUs）。

图1 稀释曲线Fig. 1 Rarefaction curve（n=4）

如表3 所示，与对照组相比，VB 组山羊盲肠内容物菌群的ACE、Chao1 和Shannon index 都有一定程度降低，但无显著变化（P>0. 05）；结肠内容物菌群的ACE、Chao1 和Shannon index 均无显著变化（P>0. 05）。

表3 山羊肠道微生物α 多样性分析Table 3 Alpha diversity analysis of intestinal microbes in goats（n=4）

2. 2 山羊盲肠和结肠内容物菌群组间差异分析

如图2、表4 和表5 所示为山羊肠道内容物菌群门水平的丰度，其中盲肠中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为优势菌门，分别占CON 组和VB 组山羊盲肠内容物菌群门水平的87. 21% 和88. 98%；与对照组相比，VB 组山羊盲肠中拟杆菌门的丰度有升高趋势（0. 050. 05）。同样山羊结肠中厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌门，分别占CON 组和VB 组山羊结肠内容物菌群门水平的87. 44% 和87. 66%；与对照组相比，VB 组山羊结肠中其他菌门无显著变化（P>0. 05）。

图2 山羊肠道微生物门水平相对丰度Fig. 2 Relative abundance of intestinal microbes in goats at phylum level（n=4）

表4 山羊盲肠微生物门水平丰度比较Table 4 Comparison of abundance of cecal microbes in goats at phylum level（n=4）

表5 山羊结肠微生物门水平丰度比较Table 5 Comparison of abundance of colonic microbes in goats at phylum level（n=4）

如图3 所示为山羊肠道菌群组间差异分析结果，与对照组相比，VB 组山羊盲肠中菌群目水平上Solirubrobacterales 和Streptomycetales 目菌群丰度显著下降（P<0. 05，图3A）；科水平上Christensenellaceae、Streptomycetaceae 和Solirubrobacteraceae 科菌群丰度显著下降（P<0. 05，图3B）；属水平上Lachnoclostridium属菌群丰度显著升高（P<0. 05），Bacillus和Nocardioides属菌群丰度显著下降（P<0. 05，图3C）。VB 组山羊结肠中菌群科水平上Christensenellaceae 科菌群丰度显著下降（P<0. 05，图3D）；属水平上unidentified_Christensenellaceae和unidentified_Gammaproteobacteria属菌群丰度显著下降（P<0. 05，图3E）。

图3 山羊肠道微生物组间差异分析Fig. 3 Analysis of intestinal microbial differences in goats（n=4）

2. 3 山羊肠道形态结构变化

如图4 所示为山羊肠道HE 染色结果，对空肠和回肠绒毛高度和隐窝深度进行测量，结果如表6 所示。与CON 组相比，VB 组山羊空肠的绒毛高度极显著增加（P<0. 01），隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度（villus height/crypt depth，V/C）都显著增加（P<0. 05）；回肠的隐窝深度显著降低（P<0. 05），但绒毛高度和V/C 无显著变化（P>0. 05）。

表6 山羊空肠和回肠组织形态的变化Table 6 Changes in morphology of jejunum and ileum in goats

图4 山羊肠道形态结构变化Fig. 4 Intestinal epithelial morphological and structural changes in goats（400×）

2. 4 山羊盲肠和结肠相关基因和蛋白表达的变化

如图5 所示，与CON 组相比，VB 组山羊盲肠中紧密连接和细胞增殖相关基因无显著变化（P>0. 05，图5A）；结肠中MIK67、CCND、Occludin基因的表达显著上调（P<0. 05），EGFR基因的表达极显著上调（P<0. 01，图5B），而Claudin1 和Claudin4 基因的表达则无显著变化（P>0. 05）。此外，结肠中ZO-1 蛋白的表达量显著升高（P<0. 05，图5C）。

图5 山羊肠道上皮相关基因和蛋白表达变化Fig. 5 Changes in genes and proteins expression in intestinal epithelium of goats（n=5）

3 讨论

3. 1 复合维生素B 对山羊肠道微生物的影响

肠道微生物被称为机体的“第二基因组”，在动物生长发育和健康中扮演了重要角色。哺乳动物肠道中厚壁菌门和拟杆菌门丰度占主导地位，为肠道的优势菌群［24］。拟杆菌门细菌不仅帮助宿主分解多糖，提高营养利用率，还促进免疫系统发育，提高宿主免疫力［25−26］。保持肠道“微生态平衡”对维护动物健康和提高其生产性能具有重要价值［27］。本试验研究发现，添加复合维生素B 对山羊盲肠和结肠菌群多样性无显著影响，但与CON 组相比，VB 组山羊盲肠中拟杆菌门的丰度有升高趋势，盲肠中Christensenellaceae 科菌群呈下降趋势，结肠中Christensenellaceae 科及其下属的unidentified_Christensenellaceae属菌群均显著下降。Christensenellaceae 菌是一种可遗传的肠道菌，现有资料表明该菌群与健康状态有关，其丰度与宿主体重呈负相关［28−29］。本试验结果与其相一致，VB 组山羊体重增加而肠道内Christensenellaceae 菌减少，但此菌的具体功能有待进一步研究。

有研究报道，Lachnoclostridium菌可抑制肠道中病原体的定殖，降低结肠炎症的危害［30−31］，且该菌群可促进短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的产生，对生长具有促进作用［32］。而Bacillus属菌群通常与食物中毒和感染有关，通过产生某些特异性的毒素如溶血素等，从而导致宿主感染产生疾病［33］。此外，螺旋菌门（Spirochaetes）中大多数细菌都属于致病菌［34］。本研究结果显示，添加复合维生素B 可显著提高山羊盲肠中Lachnoclostridium属菌群的丰度，显著降低Bacillus属菌群的丰度，且盲肠中螺旋菌门的丰度有降低趋势，说明日粮中添加复合维生素B 可增加山羊肠道内某些有益菌的丰度，降低有害菌的丰度，从而在一定程度上改善山羊肠道菌群的组成，使其向有益的方向发展，对提高动物肠道黏膜发育、饲料利用率和生长性能有潜在的积极作用。此外，本研究结果显示VB 组山羊盲肠中Solirubrobacterales 和Streptomycetales 目菌群和各自对应的科水平及Nocardioides属菌群的丰度均显著下降，但其在动物体内的具体功能尚不清楚，仍需进一步的深入研究。

3. 2 复合维生素B 对山羊肠道形态结构和肠黏膜屏障功能的影响

小肠的上皮结构是机体营养物质消化和吸收的主要场所，其绒毛高度和隐窝深度及其比值是衡量小肠消化吸收功能的关键指标［35−36］。绒毛高度影响小肠吸收面积，其高度增加有利于营养物质的吸收。绒毛高度与隐窝深度的比值则综合反映小肠的功能状态，其比值上升表示消化吸收能力增强。龙建华等［6］发现添加维生素B12可使五龙鹅的空肠绒毛高度和V/C 增加，王宝维等［7］在日粮中添加维生素B2也得到了类似结果。Sparks 等［37］的研究表明小鼠日粮缺乏维生素B1和B2会使肠道松弛，结肠张力变小，而饲喂VB1、VB2后可使结肠显著肥大。此外，有研究发现维生素B2与肠上皮细胞增殖、黏膜发育密切相关［38］。以上研究结果表明，添加维生素B2对肠道绒毛发育与消化功能具有积极作用。本研究发现，日粮添加复合维生素B 能够显著增加山羊空肠绒毛高度、隐窝深度及其比值，显著降低回肠上皮的隐窝深度。从而表明日粮添加复合维生素B 能够改善山羊空肠上皮组织形态结构，增加上皮黏膜面积，有利于肠道的消化吸收，其中VB2可能起到主要的调控作用。

紧密连接对维持肠道屏障完整性和功能具有重要意义，通过调节其选择通透性而保护机体免受肠道病原菌的侵害［39］。紧密连接蛋白是位于肠道上皮相邻细胞的一种蛋白复合体，其中闭锁小带蛋白ZO-1 和闭锁蛋白Occludin 是重要的骨架蛋白，对维持肠道内环境稳态具有重要作用［40−41］。紧密连接蛋白表达减少会使肠道紧密连接功能异常，肠道通透性增加，导致肠道稳态失衡［42］。本试验研究发现，添加复合维生素B 显著上调山羊结肠Occludin基因的表达和ZO-1 蛋白的表达。MKI67 和CCND 常作为评价细胞增殖的指标，另一个关键调节因子是内皮生长因子受体EGFR，其激活后能够促进细胞的增殖、分化和修复创伤［43］。本研究发现，VB 组山羊结肠MKI67、CCND和EGFR基因表达均显著上调。以上结果表明日粮中添加复合维生素B 有利于肠上皮细胞增殖与修复、改善肠道完整性与屏障功能，从而提升肠道的消化与保护功能。