紫花苜蓿MsWRKY11 基因的克隆及其耐盐功能分析

2021-11-22王如月文武武赵恩华周鹏安渊

草业学报 2021年11期

王如月，文武武，赵恩华，周鹏，安渊

（上海交通大学农业与生物学院，上海200240）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科草本植物，适口性好，营养价值高，富含多种微量元素，蛋白质含量丰富，有“牧草之王”的称誉。此外，苜蓿根瘤发达，改良土壤效果显著，是一种理想的水土保持草种。当前，世界可耕地面积日益减少，土壤盐渍化情况日益严重。土壤中Na+被植物吸收，对植物细胞造成渗透胁迫，膜蛋白功能受损，影响细胞膜结构稳定，从而影响植物光合、呼吸、抗氧化系统、离子运输以及营养物质吸收等诸多生理过程，最终抑制植物生长，严重时将造成植物死亡［1］。

基因转录调控在植物生长发育、衰老、响应胁迫中发挥重要作用。转录因子是植物体内一类最重要的调节基因，在植物受到外界胁迫时，会产生一系列的信号传递过程来激发转录因子对顺式作用因子进行调节，使植物产生特异性或非特异性的基因差异表达，从而对胁迫做出响应［2］。WRKY 转录因子作为最大的转录因子家族，已被广泛报道参与植物的生物胁迫、非生物胁迫、胚胎发育、新陈代谢、信号传递和叶片衰老等过程调控［3−5］。WRKY转录因子最典型的特征是其N 端具有1～2 个约60 个氨基酸的保守序列WRKYGQK，以及Cys2-His2或Cys2-His/Cys 锌指结构［6］，属于锌指型转录因子WRKY-GCM1 超家族。WRKY 蛋白可以作为转录激活子或抑制子，通过WRKY 结构域和锌指结构域，直接与靶基因启动子中核心序列（T）（T）TGAC（C/T）的W-box 结合［7］，调节基因的表达。大量研究表明，WRKY 转录因子能调控植物对盐胁迫的响应，缓解高浓度盐引起的植物伤害。拟南芥（Arabidopsis thaliana）中过量表达棉花（Gossypium hirsutum）GhWRKY34提高了转基因拟南芥的耐盐性［8］。Yu等［9］对大豆（Glycine max）基因组进行分析，发现66 个GmWRKYs对盐胁迫响应明显。超表达GmWRKY5的转基因植株通过调控转录因子STA/ZAT10 表达，增强转基因株系耐盐及抗旱性，但超表达GmWRKY13的转基因植株对盐胁迫的敏感性增强［10］。

目前，关于WRKY 转录因子调控非生物胁迫的研究多集中在干旱方面，而对盐胁迫途径调控的研究报道较少。紫花苜蓿中只有少数的WRKY 转录因子被分离、鉴定和功能研究，其对植物耐盐响应途径的调控作用仍然不清楚。本研究从紫花苜蓿中克隆得到1 个MsWRKY11基因，利用农杆菌介导法在紫花苜蓿中超表达MsWRKY11，获得转基因苜蓿株系，并对其抗盐机理进行了研究，以期为紫花苜蓿抗盐育种提供理论依据和基因资源。

1 材料与方法

1. 1 植物材料

紫花苜蓿品种为WL-525HQ，种子来源于北京正道生态科技有限公司。

1. 2 MsWRKY11 基因的克隆

使用TransZol Up Plus RNA Kit（全式金）提取紫花苜蓿总RNA，使用TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金）反转录。

通过NCBI 查找蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtWRKY11基因序列，使用Primer Premier 5. 0，根据蒺藜苜蓿MtWRKY11基因序列进行克隆引物设计，所设计引物如下：MsWRKY11-F：TCTGTTACTTTCTTCTAAT TCTTTCAAG；MsWRKY11-R：CGTCACCGTTACAGTTAGAGCAT。

以cDNA 为模板，MsWRKY11-F 和MsWRKY11-R 为上下游引物进行PCR 反应，反应体系为20 μL：cDNA 1 μL、MsWRKY11-F/R 0. 8 μL、Ex-taq 酶10 μL、ddH2O 7. 4 μL，反应程序为95 ℃预变性3 min，95 ℃预变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30 个循环，72 ℃5 min，4 ℃保存。所得PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳（400 A，120 V，30 min），电泳结束后在紫外光下将正确大小的胶体切下，使用FastPure®Gel DNA Extraction Mini Kit（天根）进行胶回收。

1. 3 生物信息学分析

利用MEGA 5. 0 构建系统进化树；使用NCBI 将PCR 产物测序结果与MtWRKY11序列进行比对，分析蛋白保守结构域；利用ExPASy-Protparam Tool（https：//web. expasy. org/protparam/）在线分析蛋白亲疏水性；利用在线软件TMHMM Server v. 2. 0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）对MsWRKY11 进行跨膜结构域预测；通过Npsa-Prabi（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/）分析MsWRKY11 蛋白二级结构；通过I-TASSER（https：//zhanglab. ccmb. med. umich. edu/I-TASSER/）对MsWRKY11 的三级结构进行预测。

1. 4 盐（NaCl）、水杨酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jamonic acid，JA）处理下MsWRKY11 基因表达分析

2018 年9 月将种子洗净后置于含有浸润滤纸的铁盘中，于25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），光照时长14 h，光照强度400 μmol·m−2·s−1，相对湿度为65% 的人工培养室萌发，待根长达到7 cm 左右进行试验。将幼苗转移至1/2 Hoagland 营养液（pH 5. 8）的桶中培养3 d 后在营养液中分别加200 mmol·L−1NaCl 或100 mmol·L−1JA 或100 mmol·L−1SA，每2 d 更换一次营养液。处理0、0. 5、1、3、6、9、12、24 h 时，每个处理分别随机取0. 1 g 幼苗叶片和0. 1 g 根保存于−80 ℃冰箱备用，重复3 次。提取样品RNA（全式金RNA 提取试剂盒）并反转录，将得到的cDNA稀释5 倍作为模板，以紫花苜蓿EF-α作为内参基因，利用qRT−PCR 分析MSWRKY11的表达模式。反应体系为20 μL：cDNA 2 μL、Primer-F/R 0. 4 μL、PerfectStartTM Green qPCR SuperMix（全式金）10 μL、ddH2O 7. 2 μL，反应程序为95 ℃预变性3 s，94 ℃预变性5 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸15 s，39 个循环，72 ℃15 s，95 ℃10 s，65 ℃升至95 ℃获取溶解曲线。所用引物见表1。每个样品重复3 次。使用C（t）值确定基因的表达水平，并使用2−ΔΔC（t）方法进行计算。

1. 5 紫花苜蓿遗传转化及转基因植株鉴定

将“WL-525HQ”紫花苜蓿种子洗净置于60 ℃烘箱高温杀菌7 d，点种于含MS 培养基（MS 2. 22 g·L−1、蔗糖15 g·L−1，凝胶3. 5 g·L−1，pH 5. 8）的广口瓶中，于25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），光照时长14 h，光照强度400 μmol·m−2·s−1的环境中培养30 d。构建CaMV35S 启动的PHB-MsWRKY11-Flag 表达载体转化GV3101 农杆菌。利用叶盘法侵染紫花苜蓿叶片，在MS 培养基中24 ℃暗培养4～5 d。随后在SM4 选择培养基（MS 4. 43 g·L−1、蔗糖30 g·L−1、2，4-D 4 mL·L−1、6BA 0. 2 mL·L−1，凝胶3. 5 g·L−1，pH 5. 8）、MSBK 培养基（MS 4. 43 g·L−1、蔗糖30 g·L−1、KT 1 mL·L−1、6BA 0. 5 mL·L−1，凝胶3. 5 g·L−1，pH 5. 8，灭菌后加入1 mL·L−1Cef、Timentin 1 mL·L−1、200 μL·L−1Hyg）、MSS 培养基（MS 2. 22 g·L−1、蔗糖15 g·L−1，凝胶3. 5 g·L−1，pH 5. 8，灭菌后加入Cef 1 mL·L−1、Timentin 1 mL·L−1、Hyg 200 μL·L−1）、MSR 培养基（MS 2. 22 g·L−1、蔗糖15 g·L−1，琼脂7. 5 g·L−1，IAA 1 mL·L−1，pH 5. 8）中进行培养，每2 周更换一次培养基，直至获得完整植株。同时以非转基因“WL-525HQ”（野生型）为阴性对照。挑选生长良好的再生植株进行PCR 鉴定阳性株系，并利用qRT−PCR 检测MSWRKY11的表达量。

1. 6 盐胁迫处理及相关生理指标测定

2019 年8 月，选取生长旺盛且较一致的MsWRKY11过表达株系及野生型株系，剪成7 cm 左右的枝条，扦插于蛭石∶草炭（1∶1）基质中，置于人工培养室中生长20 d，每株系随机选取6 盆，浇灌含250 mmol·L−1NaCl 的1/2Hoagland 营养液，另外6 盆作为对照，处理15 d。地上生物量测定：每3 株幼苗为1 个重复，取地上部分测定鲜重，重复3 次。株高测定：每4 株幼苗为一个重复，用直尺测量株高，重复3 次。相对电导率测定：称取叶片0. 1 g于25 mL 超纯水中，25 ℃摇床250 r·min−1摇24 h，测定电导率（E1），121 ℃高温高压煮沸15 min，冷却至室温后测定电导率（E2），相对电导率=（E2−E1）/ E2，重复3 次。使用科铭生物试剂盒测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧阴离子含量、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性，每处理重复3 次。NBT 染色：25 mmol·L−1的HEPES 溶液用NaOH 调节pH 至7. 6，溶解NBT 于HEPES buffer 中，终浓度为0. 1 mg·mL−1，作为NBT 染色液备用，取顶芽开始的第6～7 个叶片浸泡于染色液中，每株系6 片，真空15 min后29 ℃黑暗条件下染色2 h，75% 乙醇65 ℃脱色，拍照记录。钠、钾元素含量测定：每3 株幼苗为1 个重复，烘干、称重后放于50 mL 离心管中，加入1 mL HNO3、1 mL H2O2，消煮3 h，静置过夜后取上清液，用电感耦合等离子体发射光谱仪（Optima 8000，铂金埃尔默，美国）测定钠、钾元素含量，每处理重复3 次。

1. 7 耐盐相关的基因表达模式分析

选取生长旺盛且较一致的MsWRKY11过表达株系及野生型株系，剪成7 cm 左右的枝条，扦插于1/2 Hoagland 营养液（pH 5. 8）的桶中培养14 d 后在营养液中分别加200 mmol·L−1NaCl，每2 d 更换一次营养液。在处理0、6、12、24、48 h，随机取0. 1 g 幼苗叶片保存于−80 ℃冰箱备用，重复3 次。提取样品RNA 并反转录，将得到的cDNA 稀释15 倍作为模板，以紫花苜蓿EF-α作为内参基因，利用qRT−PCR 方法检测耐盐性相关的6 个关键基因MsNHX1、MsSOS3、MsAPX、MsGRX、MsNAC和MsP5CS在野生型和转基因株系中的表达模式（对照处理野生型的基因表达量设定为1）。每个样品重复3 次。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2 结果与分析

2. 1 MsWRKY11 基因的克隆及生物信息学分析

以“WL-525HQ”紫花苜蓿cDNA 为模板，MsWRKY11-F、MsWRKY11-R 为引物，通过PCR 扩增获得960 bp的条带（图1A），回收、克隆、测序，将核苷酸序列在NCBI 上进行Blast 比对，与蒺藜苜蓿WRKY11相似性为94. 00%（图1B）。

图1 MsWRKY11 的克隆及序列比对Fig. 1 The cloning and sequence alignment of MsWRKY11

2. 2 MsWRKY11 系统进化树分析及同源蛋白多序列比对分析

使用MEGA-X 构建系统进化树，发现MsWRKY11 与蒺藜苜蓿WRKY11 转录因子亲缘关系最近（图2A）。利用DNAMAN 将MsWRKY11基因所编码的氨基酸序列进行多序列比对，发现MsWRKY11 含有一个WRKY结构域，锌指结构为C2H2型（图2B）。

图2 MsWRKY11 系统进化树分析与同源序列比对Fig. 2 Analysis of MsWRKY11 evolutionary tree and sequence alignment

2. 3 MsWRKY11 蛋白结构分析

在线分析结果显示，MsWRKY11 为非跨膜蛋白，疏水性氨基酸占25%，亲水性氨基酸占75%，表明MsWRKY11 为亲水蛋白。蛋白二级结构预测结果显示，MsWRKY11 主要由10. 03% α-螺旋（alpha helix）、67. 71% 无规则卷曲（random coil）和22. 26% 延伸带（extended strand）组成，无其他结构（图3A）。三级结构预测结果（图3B）与二级结构相符。

图3 MsWRKY11 蛋白结构预测Fig. 3 MsWRKY11 protein structure prediction

2. 4 MsWRKY11 基因在NaCl、水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）处理下的表达模式

利用实时荧光定量PCR 分析了200 mmol·L−1NaCl 处理下MsWRKY11的表达情况，结果显示MsWRKY11对盐胁迫响应明显，上调表达（图4A 和D），其中，在根中的表达量变化较大，并且在根中呈现单峰型，而在叶中呈现震荡型变化趋势。

为了明确激素对MsWRKY11诱导表达的影响，在营养液中添加SA 和JA 处理紫花苜蓿幼苗24 h，结果显示：SA 和JA 处理下，根中MsWRKY11的表达量均上调，最高值依次达到3. 72 和8. 33（图4B 和C）。并且，MsWRKY11对SA 的响应比JA 敏感，SA 处理0. 5 h，MsWRKY11表达量即呈现较高的水平，3 h 达到最大值，而JA 处理3 h 时，MsWRKY11表达量才明显升高，9 h 达到最高水平。在叶中，SA 处理的MsWRKY11呈现波动性上调表达，最高值达到4. 25（图4E）；而JA 处理下，MsWRKY11呈现下调表达的趋势（图4F）。

图4 NaCl、SA 和JA 处理下MsWRKY11 在根和叶片中的表达模式Fig. 4 The expression pattern of MsWRKY11 in leaves and roots under NaCl，SA and JA treatment

2. 5 MsWRKY11 转基因紫花苜蓿鉴定

PCR 鉴定结果表明，OE-1、OE-3、OE-4 和OE-7 为转基因阳性株系（图5A），利用qRT−PCR 检测转MsWRKY11基因紫花苜蓿的表达量，OE-1、OE-3、OE-4 和OE-7 株系的MsWRKY11基因表达量分别为野生型的8. 12、6. 38、19. 26 和2. 88 倍，为MsWRKY11超表达株系。

图5 转MsWRKY11 紫花苜蓿植株鉴定Fig. 5 Identification of transgenic alfalfa

2. 6 转基因紫花苜蓿抗盐性分析

2. 6. 1 过表达MsWRKY11紫花苜蓿在盐胁迫下的表型分析正常生长状态下，野生型（wild type，WT）和4个转基因株系（OE-1、OE-3、OE-4 和OE-7）均生长良好（图6A），但在盐胁迫下，WT 表现出株高较低、叶片发黄的表型，而转基因株系呈现良好的生长表型，株高较高，叶色较绿（图6B）。对其中3 个转基因株系进行地上生物量（图6C）和株高（图6D）测定，均呈现出转基因株系比WT 高的趋势，表明MsWRKY11具有增加苜蓿抗盐胁迫的功能。

图6 盐胁迫下MsWRKY11 转基因株系的表型变化Fig. 6 Phenotype analysis of MsWRKY11 transgenic lines under salt stress

2. 6. 2 过表达MsWRKY11对盐胁迫下紫花苜蓿膜脂过氧化的影响过表达MsWRKY11能够显著降低盐胁迫对紫花苜蓿的伤害。正常生长条件下，野生型和转基因株系的相对电导率（图7A）和MDA 含量（图7B）无显著差异，而盐处理下，转基因株系的电导率和MDA 含量显著低于野生型，其中OE-3 电导率和MDA 含量最低。

图7 盐胁迫对过表达MsWRKY11 紫花苜蓿细胞膜脂过氧化的影响Fig. 7 Effect of overexpression of MsWRKY11 on membrane lipid peroxidation of alfalfa under salt stress

2. 6. 3 过表达MsWRKY11对盐胁迫下紫花苜蓿抗氧化能力的影响正常生长条件下，野生型和转基因株系超氧阴离子含量无显著差异（图8B），但在盐胁迫下，野生型苜蓿受到严重的氧化伤害，叶片NBT 染色（图8A）后呈现出明显的蓝色，而转基因苜蓿叶片的蓝色较浅。野生型植株的超氧阴离子含量显著高于转基因株系，与NBT 染色结果一致。盐胁迫下，过表达株系的POD 和CAT 活性均显著高于野生型（图8C 和D），表明转MsWRKY11基因紫花苜蓿的抗氧化胁迫性能明显提高。

图8 过表达MsWRKY11 对盐胁迫下紫花苜蓿抗氧化胁迫能力的影响Fig. 8 Effects of overexpression of MsWRKY11 on alfalfa antioxidant ability under salt stress

2. 6. 4 盐胁迫下过表达MsWRKY11对紫花苜蓿Na+含量和K+/Na+的影响盐胁迫下过表达MsWRKY11能够显著降低紫花苜蓿体内Na+含量，增加K+/Na+。盐胁迫下转基因株系OE-7 根系和叶片中Na+含量均显著低于野生型（图9A 和B），OE-3、OE-4 和OE-7 根系中K+含量高于WT（图9C），OE-3 和OE-7 叶片中K+的含量高于WT，而OE-4 叶片中K+含量低于野生型，但差异不显著（图9D）。OE-3、OE-4 和OE-7 根系和叶片中K+/Na+高于野生型（图9 E 和F），表明MSWRKY11能够减少根系对Na+的吸收。

图9 盐胁迫下转基因紫花苜蓿幼苗的K+、Na+含量和K+/Na+Fig. 9 Content of K+，Na+ and ratio of K+/Na+ in alfalfa seedlings under salt stress

2. 6. 5 盐胁迫下过表达MsWRKY11对紫花苜蓿盐胁迫相关基因表达的影响MsNHX1、MsSOS3、MsAPX、MsGRX、MsNAC和MsP5CS是6 个对盐胁迫响应敏感，参与植物耐盐调控途径的基因。过表达MsWRKY11明显改变了6 个关键基因（图10）对盐胁迫的响应模式，其中，在正常生长环境下，6 个基因在转基因株系和野生型植株中的表达呈现高低相互变化的动态格局，但在盐胁迫下，除MsSOS3在12 h 外，转基因株系中6 个基因的表达量均高于野生型，表明盐胁迫下MsWRKY11通过上调这6 个基因的表达，参与调控苜蓿对盐胁迫的响应过程，从而提高转基因苜蓿的耐盐能力。

图10 盐胁迫下转基因紫花苜蓿耐盐相关基因的表达变化Fig. 10 Expression patterns of key genes related to salt stress in transgenic alfalfa under salt stress

3 讨论

土壤盐渍化作为作物生长的主要抑制因素，影响作物对水分和营养物质的吸收，引起细胞渗透胁迫，破坏细胞膜透性和细胞结构。土壤中高含量的盐还会影响细胞对其他阳离子的吸收，间接导致作物营养缺乏，甚至造成单盐毒害，严重影响作物的产量和品质［11］。提高作物的耐盐性是作物育种的主要目标之一。WRKY 转录因子是最大的转录因子家族之一，大量报道［2−6，8−10］表明，WRKY 参与拟南芥、水稻、玉米等植物的盐胁迫应答，但是关于紫花苜蓿WRKY 转录因子的研究鲜有报道。本研究利用同源克隆法从紫花苜蓿中克隆到MsWRKY11，蛋白序列分析发现MsWRKY11 与MtWRKY11 亲缘关系最近，N 端具有WRKYGQK 保守序列，以及C2H2锌指结构。诸多研究表明，植物的WRKY 转录因子参与激素和非生物胁迫应答，如大麦HvWRKY38受GA 诱导下调表达，受ABA 和JA 诱导上调表达［12］；AtWRKY25、AtWRKY28、AtWRKY40和AtWRKY70受盐害、冷害和渗透胁迫的诱导［13］，AtWRKY75和OsWRKY72受高温诱导迅速上调表达［14］。本研究发现，MsWRKY11响应NaCl、JA 和SA 的诱导，表明MsWRKY11参与盐胁迫的应答。因此，本研究通过叶盘法得到MsWRKY11转基因紫花苜蓿，并对其进行盐胁迫处理，进一步研究MsWRKY11转基因紫花苜蓿的抗盐性。结果表明，盐胁迫下超表达MsWRKY11转基因紫花苜蓿株系的株高和鲜重显著高于野生型，并且野生型植株呈现出明显的黄化现象，但转基因株系生长状况良好，无明显黄化现象，这个现象与OsWRKY45和OsWRKY72过表达转基因水稻表现一致［15］，说明MsWRKY11基因具有调控紫花苜蓿抗盐胁迫的功能，超表达MsWRKY11能够缓解盐胁迫对紫花苜蓿的抑制作用。

盐胁迫条件下，植物过度吸收Na+会干扰K+依赖的酶促过程，影响K+的吸收［16］，因此，维持细胞质高K+的能力是植物耐盐性的关键决定因素之一［17−18］。为了进一步研究MsWRKY11转基因株系耐盐的生理机制，测定了盐胁迫下紫花苜蓿叶片和根系中的K+和Na+含量。结果发现转基因株系中Na+含量低于野生型，K+含量高于野生型，K+/Na+增高，说明MsWRKY11能够阻止Na+进入细胞，缓解K+和Na+的竞争作用，促进K+摄取，维持苜蓿体内的K+/Na+内稳态，降低Na+离子毒性，与Li 等［19］的研究结果一致。

盐胁迫条件下，植物细胞膜受到伤害，体内会产生大量活性氧，这是导致盐胁迫下细胞过氧化和细胞凋亡的主要原因之一［20］。植物体内MDA 含量、超氧阴离子含量和电导率均能反映植物细胞膜受伤害的程度［21］。本研究中，盐胁迫条件下转基因株系和野生型的电导率、MDA 含量和超氧阴离子含量均有所增加，说明盐胁迫使紫花苜蓿膜脂结构受到伤害，活性氧积累增加。但是转基因株系叶片的电导率、MDA 含量和超氧阴离子含量均低于野生型，说明转基因株系细胞膜的损伤程度较小。抗氧化酶系统的平衡直接影响植物对逆境的耐受能力，SOD、POD、CAT 等抗氧化酶在抗氧化系统中相互协调、共同作用达到清除活性氧的作用［22］。250 mmol·L−1NaCl 处理下，转基因株系的CAT 和POD 酶活性明显高于野生型，说明MsWRKY11超表达株系具有更高的活性氧清除能力，从而明显降低了转基因株系体内超氧阴离子含量，降低转基因株系叶片的相对电导率和MDA 含量，减轻了膜系统的伤害，提高转基因植株的耐盐能力。

植物对非生物胁迫的响应受到多个基因调节，Chinnusamy 等［23］将这些基因分为两类：第一类编码功能蛋白，第二类参与信号转导通路和表达调控过程。为了进一步探讨MsWRKY11增强紫花苜蓿耐盐机制，分析了与盐胁迫相关的基因表达变化。谷氧还蛋白（GRX）是谷氧还蛋白系统的主要部分，与还原脱氢抗坏血酸、过氧化物氧还酶与甲硫氨酸亚砜还原酶等共同作用来发挥其抗氧化保护作用［24］。马进等［25］对盐胁迫下紫花苜蓿转录组的研究发现，MsGRX在盐胁迫后上调表达，说明MsGRX参与苜蓿盐胁迫应答。抗坏血酸过氧化物酶（APX）是抗坏血酸−谷胱甘肽循环中的关键酶，能够清除植物体中的H2O2。已有研究表明APX的过表达能够增强APX 酶活性，从而增强植物的抗逆性［26］。本研究中，盐胁迫下APX的表达量迅速诱导表达，在处理6 h 表达量达到最大值，并且在0～48 h 内表达量呈现增长趋势，OE-3 和OE-4 的表达量始终高于WT；在盐处理各个时期GRX表达量均高于对照处理，在盐处理12、24 和48 h 内OE-3 和OE-4 的表达量始终高于WT，说明盐胁迫下过表达MsWRKY11会引起MsGRX和MsAPX上调表达，从而保护抗氧化酶的活性，有效地清除植物体内的过氧化物，调节细胞抗氧化系统的平衡，这与郭玉双等［24］和Guo 等［27］的研究结果一致。植物中Na+/H+逆向转运有两种类型：质膜（SOS）和液泡膜（NHXs）Na+/H+逆向转运。SOS1 负责排出细胞质中的Na+［28］，SOS3 和SOS2 能够激活SOSl 的表达。NHX 是K+在细胞质和液泡之间转运的中介，负责将细胞质的Na+转运到液泡中，完成盐的区隔化，减少细胞质中潜在的有害离子［29］。超表达SOS1提高了拟南芥的耐盐性［30］；耐盐性更强的黄花苜蓿（Medicago falcate）MfSOS1表达量高于敏感型［31］。OsNHX1［32］、HvNHX1［33］和ZxNHX［34］都参与盐胁迫应答，并在其中起到正向调控作用。本研究发现，盐胁迫0～48 h 内OE-3 和OE-4 中MsNHX1的表达量均高于野生型。盐处理6 h 时WT 叶片中SOS3的表达量高于OE-3 和OE-4，但是在处理24 h 后，WT 中SOS3的表达量迅速下降，低于OE-3 和OE-4，说明MsWRKY11超表达引起盐胁迫株系MsNHX1和MsSOS3上调，将胞质中的Na+更多地转移到液泡中，保护细胞不受渗透胁迫。NAC 是非常重要的一类转录因子，响应干旱、高盐、低温、渗透等非生物胁迫，并在胁迫应答和调节中起重要作用。水稻OsNAC2/6/10均能响应盐胁迫，增强水稻的耐盐能力［35−36］。黄花苜蓿MfNAC4通过调控盐胁迫响应基因MtZpt2-1提高了其盐耐受性。本研究中转基因株系的MsNAC的表达在盐胁迫下显著提高，而野生型中MsNAC对盐胁迫的响应程度低于转基因株系，因此，本研究推测MsWRKY11引起盐胁迫下NAC 转录因子上调表达，从而激活了其下游盐耐受基因的表达，增强了转基因苜蓿的耐盐性。P5CS基因是脯氨酸合成过程中的重要调控基因［37］，Ginzberg 等［38］的研究表明MsP5CS基因能够被盐胁迫诱导激活，并在盐胁迫应答中起调节作用。在盐处理0～48 h 内转基因株系的MsP5CS表达量均高于野生型，说明MsWRKY11超表达引起的MsP5CS表达上调可能会导致脯氨酸合成增加，从而增加转基因苜蓿体内的脯氨酸含量，调节渗透势，降低盐胁迫伤害。