牡丹籽壳黑色素应用研究*

张海丽，毕 珂，陈长坤，赵乐为，朱 陶

(菏泽学院农业与生物工程学院，山东 菏泽 274015)

引言

黑色素(Melanin)是广泛存在于生物体中的一种棕黑或黑色色素，它是一类多酚聚合体或吲哚生物大分子，是头发、皮肤、植物组织等表现黑色的本源，按植物黑色素的结构可以将植物黑色素分为两大类：一类为酪氨酸、多酚及其相关化合物代谢的最终产物；另一类为花色昔类.植物黑色素具有广泛的生物活性，包括延缓衰老、调节免疫力、抗紫外、抗氧化、清除自由基、保护心血管等，富含人体必需的营养物质和对人体有益的微量元素，如Fe、Mn、Cu等，同时，相对于合成黑色素而言，植物黑色素副作用小、安全性高，所以在食品加工、化妆品开发等方面都具有广阔的应用前景.植物黑色素应用范围很广，它不仅是一类光保护剂、抗辐射剂、螯合剂、生物抗氧化剂和免疫促进剂，而且还可用作生物半导体材料和光电传递材料，具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒复制、治疗帕金森症等作用，在农业、工业、医药等方面有着广泛的应用前景[1].

白亮[2]等探讨了黑芝麻黑色素的自由基清除活性，结果表明黑芝麻黑色素对DPPH·有很强的清除能力.姚增玉等[3]分别测定了山杏种皮黑色素、抗氧化剂BHT和抗坏血酸(Vc)的清除自由基能力，结果表明，山杏种皮黑色素具有较强的清除羟自由基能力，其效果接近BHT而高于Vc，清除超氧阴离子的能力高于BHT和Vc.山杏种皮黑色素既可作为氢供体，清除DPPH·，但清除能力低于BHT和Vc；也可作为电子供体，还原能力高于BHT和Vc.还有研究表明，灵芝黑色素[4]具有较强的OH自由基和O2-自由基清除活性，是一种非常有潜力的天然黑色素.上述研究为从天然植物中寻找消除自由基剂和抗氧化资源提供了依据.

压榨法制备牡丹籽油的过程中会产生大量的牡丹籽壳等副产物，本研究以牡丹籽壳为原料，研究了牡丹籽壳中黑色素提取和纯化的工艺条件，黑色素的理化性质，作为美妆着色剂的稳定性、抗氧化活性，提高了油用牡丹深加工产品的附加值，同时为进一步的工业化开发利用提供理论和技术依据.

1 材料与方法

1.1 材料

牡丹籽壳,成熟牡丹籽晒干去黑色硬壳，种仁用来榨油，籽壳作为附属产物，无法直接被应用，大都被当作废物丢弃.

1.2 方法

1.2.1 黑色素提取的方法

本文以生产牡丹籽油后的牡丹籽壳为原料，采用超声波辅助萃取技术，将乙醇作为提取剂，提取牡丹籽壳中的黑色素，通过旋转蒸发的减压蒸馏方法获取黑色素的粗品，再通过热碱溶解、用酸调pH析出沉淀，最后减压、过滤、干燥得到牡丹籽壳黑色素的精品[5].

1.2.2 黑色素总抗氧化能力的测定方法

本文配制了36 mL FRAP工作液，先称取0.027 8 g FeSO4溶于双蒸水定容至100 mL，取8支试管编号，配制一组不同浓度的FeSO4溶液：0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L，方法如下：分别加入10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL、4 mL、3 mL的水，加入0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL的1 mmol/L FeSO4溶液，再取8支试管分别加入4 mL的工作液和0.6 mL各浓度的FeSO4溶液混匀，37 ℃水浴加热10 min，并根据光密度值绘制标准曲线.

分别配制浓度为0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL的牡丹籽壳黑色素溶液，取5支试管分别加入4 mL的工作液和0.6 mL各浓度的牡丹籽壳黑色素溶液，混匀，37 ℃水浴加热10 min后进行定量测定[6].

1.2.3 黑色素对DPPH自由基清除能力的测定

首先配制不同浓度的牡丹籽壳黑色素溶液，梯度为1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL，再称取NaCl 8.5 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.85 g，KH2PO40.27 g，溶于蒸馏水，定容至100 mL制得0.01 mol/L PBS，最后配制0.2 mmol/L DPPH溶液，按要求加入各浓度色素溶液2 mL、DPPH 2 mL、PBS 100 μL，避光反应20 min，517 nm下测各样品的光吸收值.

1.2.4 黑色素对OH自由基清除能力的测定

配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L H2O2溶液和9 mmol/L水杨酸溶液，再分别配制1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL的牡丹籽壳黑色素溶液，在10 mL的试管中依次加入9 mmol/L FeSO4的溶液1 mL，浓度分别为1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL的牡丹籽壳黑色素溶液1 mL，1 mL 9 mmol/L的H2O2溶液，摇匀，静置10 min，再加入9 mmol/L的水杨酸溶液2 mL，摇匀，37 ℃反应30 min，以去离子水进行参比，在510 nm下测量各样品的光密度值.

1.2.5 黑色素对O2-自由基清除能力的测定

配制50 mmol/L PH8.2 Tris-HCI缓冲液和50 mmol/L邻苯三酚溶液，再分别配制0.001 mg/mL、0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL的牡丹籽壳黑色素溶液，在反应体系中依次加入pH8.2，50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液3.8 mL，25 ℃预热50 mmol/L的邻苯三酚溶液0.2 mL，25 ℃保温10 min，再依次分别加入各浓度样品溶液2 mL，将混合物于25 ℃下反应20 min，在327 nm下测定光密度值A3；将邻苯三酚溶液用等体积25 ℃预热0.1 mol/L HCl溶液代替，其他操作相同，测定光密度值A2；将样品溶液用等体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定光密度值A1.

1.2.6 黑色素产品的制作

眼线液笔的制作过程如下.聚乙烯吡咯烷酮∶氧化铁黑∶氧化铁蓝∶聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯∶丙二醇∶防腐剂∶乙醇∶超纯水=22∶5∶20∶1.5∶5∶0.5∶5∶41，按比例将各组分溶于水中并加入适量黑色素即得.

睫毛膏的制作过程如下.硬脂酸三异丙醇酰胺∶石蜡(60 ℃)∶川蜡∶蜂蜡∶巴西棕榈蜡∶羊毛脂∶无机颜料∶抗氧剂=32∶26∶5∶9∶2∶12∶14∶适量，按比例将各原料混合并加入适量黑色素即得.

2 结果与分析

2.1 黑色素的提取

采用75%乙醇作为黑色素的提取剂，且提取剂可以循环使用，无污染、无毒、成本低；超声波萃取与常规溶剂萃取相比，时间短(30 min)、产率高(>10%)、条件温和(温度仅需45 ℃)，因而节能.

2.2 黑色素总抗氧化能力的测定结果

2.2.1 标准曲线的绘制

FRAP工作液呈茶色，当遇到FeSO4时会发生一系列的化学变化.使其呈现蓝色，根据加入的FeSO4的浓度的不同，会呈现一系列梯度的蓝色，且颜色深浅程度与FeSO4呈线性关系进而绘出标准曲线，样品的总抗氧化能力就通过FeSO4的数量关系表现出来.

对0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L FeSO4标准溶液依次在593 nm处测光密度值，结果如表1所示.以光密度值为纵坐标，FeSO4标准样溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示，R2=0.993 4，标准曲线方程为y=1.181 5x-0.045 4，为下步测牡丹原花色素总抗氧化能力做准备.

表1 FeSO4标准溶液在不同浓度对应的光密度值

图1 FeSO4标准曲线

2.2.2 牡丹籽壳黑色素总抗氧化能力的测定

对0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL牡丹籽壳黑色素溶液进行定量测定，结果如表2所示，可以看出其总抗氧化能力随着色素溶液浓度的增大而增强.

表2 牡丹籽壳黑色素总抗氧化能力的测定结果

2.3 黑色素对DPPH自由基清除能力的测定结果

DPPH(二苯代苦味酰基自由基)的乙醇溶液呈紫色，其自由基有单个电子，在517 nm处有特征吸收峰，当有自由基去除剂存在时，由于单电子配对从而使高吸收峰逐渐消失，醇溶液也开始褪色，且褪色程度与接受配对的电子数量呈线性关系，因而可用分光光度法进行定量分析.

DPPH自由基清除率(%)=

[1-(As-Ab)/Ac] ×100%[7]

(1)

式(1)中，As为牡丹原花色素溶液样品与DPPH自由基混合后的光密度值；Ab为样品液不加DPPH自由基的光密度值；Ac为不加样品液的DPPH自由基溶液的空白光密度值.

结果如表3所示，由表3可以看出其对DPPH自由基具有很高的清除能力，且清除能力随着色素溶液浓度的增大而增强.

2.4 黑色素对OH自由基清除能力的测定结果

利用H2O2与Fe2+混合产生OH自由基，OH自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可在体系中加入水杨酸捕捉体系中的OH自由基并产生有色物质，该物质在510 nm下有最大吸收峰.当有自由基去除剂存在时，生成的OH自由基就会减少，从而使有色化合物的量相应减少.采用固定反应时间法，在510 nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，以测定被测物对羟自由基的清除作用.

OH自由基清除率(%)=

[1-(A-A1)/A0] ×100%[8]

(2)

式(2)中，A为加入样品和显色剂H2O2的光密度值；A1为样品液不加显色剂H2O2色素溶液的光密度值；A0为不加样品液的空白对照的光密度值.

结果如表4所示，由表4可以看出其对OH自由基清除能力非常强，且清除能力随着色素溶液浓度的增大而增强.

表4 牡丹籽壳黑色素溶液对OH自由基清除率

2.5 黑色素对O2-自由基清除能力的测定结果

超氧阴离子自由基很难用一般方法产生和检测，但是在弱碱性条件下，邻苯三酚能发生自氧化反应，生成O2-自由基和有色中间物质，该中间物质在327 nm处有一特征吸收峰.在初始阶段，中间产物的量与时间成线性关系.当加入O2-自由基清除剂时，其能迅速与O2-自由基反应，从而阻止中间产物的积累，致使溶液在327 nm处吸收减弱.故可以通过测定OD327来评价清除剂对O2-自由基的清除作用.

O2-自由基清除率(%)=

[1-(A3-A2)/A1] ×100%[9]

(3)

式(3)中，A1为不加入样品的空白对照的光密度值；A3为加入样品液和邻苯三酚的色素溶液的光密度值；A2为不加邻苯三酚的色素溶液的光密度值.

结果如表5所示，由表5可以看出其对O2-自由基清除能力非常强，且清除能力随着色素溶液浓度的增大而增强.

表5 牡丹籽壳黑色素溶液对O2-自由基清除率

2.6 黑色素产品的制作结果

黑色素加工产品如图2所示，A为眼线液笔，B为睫毛膏.从外观上看，我们的黑色素加工产品相对于普通产品来说颜色更深，除此以外，我们的产品还具有防紫外线、抗氧化、清除自由基等多重功效.本实验得到的眼线液笔顺滑易涂、一笔成型，并且防水耐汗，冲洗摩擦不易掉色，全天持妆无惧晕染，温和易卸洁净无残留.睫毛膏膏体不易结块，无香精不刺激，轻松刷出纤长浓密卷翘睫毛，放大双眼效果极佳.

图2 黑色素产品图

3 讨论

植物黑色素安全性较高，应用范围很广，但生产中缺乏黑色素含量高具有开发利用价值的原料.从植物中寻找和开发天然黑色素，具有重要的理论意义和实际价值.

牡丹籽油是牡丹籽脱壳后得到的牡丹籽仁经压榨法得到的油，大量的牡丹籽壳作为榨油的副产物被丢弃[10].本文以副产物牡丹籽壳为材料提取了天然有机成分黑色素并对其进行实验探究和验证，继而将其添加入美妆产品，形成具有牡丹特色的化妆产品，不仅实现了对牡丹籽壳的深度开发，减少了牡丹籽壳研究价值的流失，同时推出了牡丹特色产品，且产品不仅无任何毒副作用，并且具有极强的抗氧化、抗紫外线、抗辐射、调节免疫力的功能.这些特色产品对牡丹深加工产品市场的拓展及中国化妆品的新兴市场的开发具有很好的推进作用，目前我们已将提取的黑色素添加到制作的美妆产品如眼线液笔、睫毛膏中，今后，我们还会继续推出眉笔、眉粉等具有牡丹特色的美妆产品，更好地促进牡丹废弃资源深度开发和中国彩妆市场的发展.