一种纯中药皮肤抑菌剂制作工艺条件的研究

2021-11-22刘美慧邓恵静苏小兵刘欣颖杨忞晖

辽宁科技学院学报 2021年4期

刘美慧，邓恵静，苏小兵，刘欣颖，杨忞晖

(辽宁科技学院生物医药与化学工程学院，辽宁本溪117004)

目前市场上常用皮肤抑菌剂的主要成分大多是化学合成物质,有的虽然抑菌作用较强，但具有一定的毒性，对人体易产生耐药性，对环境也有一定的污染性〔1〕，而中草药具有安全性高、来源广泛、疗效持久、无耐药性、携带方便等优势，故研发纯中药皮肤抑菌剂具有广阔的市场前景。本研究根据中药理论筛选八种中药，研究其不同配比在不同的溶剂、温度、浸泡方式、浸泡时间等工艺条件下，对几种菌体的抑菌效果，为进一步制作纯中药皮肤抑菌剂提供科学的工艺条件参数。

1 材料及主要试验设备

1.1 试验材料

药剂：黄柏、苦参、藿香等八种中草药，均购于本溪成大方圆医药店。

实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、青霉菌等菌种由辽宁科技学院无菌实验室提供。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、察氏培养基

1.2 试验设备

超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、XO-150超声波细胞破碎机。

2 试验方法

2.1 药剂制备

将八种中药破碎成粉末，以无菌水、75%浓度乙醇、5%、7.5%、10%醋酸分别作为溶剂，按A组(2∶2∶2∶1∶1∶1∶0.5∶0.5)、B组(1∶2.5∶2.5∶1.5∶1∶0.5∶0.5∶0.5)、C组(2.5∶1.5∶1.5∶0.5∶1.5∶1.5∶0.5∶0.5)三个比例混合及各单味药剂，制成含生药量0.005 g/ml、0.01 g/ml、0.02 g/ml,放置在20 ℃、28 ℃、36 ℃下，经2天、5天、8天传统浸泡。超声波萃取是将一定量中药放入最适浓度溶剂进行超声破碎，设定功率为150 W ,频率为20 kHz,工作时间5分，获得各种处理的药剂提取液。

2.2 供试菌液的制备

取新鲜菌株斜面培养物，将菌株接种到液体培养基中培养，细菌在37 ℃、霉菌在28 ℃条件下，摇床振荡约18小时，用无菌生理盐水稀释成浓度为1×106～1×107cfu/ml的菌悬液〔2〕。

2.3 滤纸片制备

用打孔器将化学分析滤纸制成6 mm的圆片置于培养皿中，干热灭菌 2天(160 ℃)，冷却后，在无菌状态下将1 mL提取的药液加入培养皿中，让其充分渗透后将滤纸片放入已灭菌的平皿中待用。

2.4 滤纸片抑菌试验

将培养基制成平板，用移液枪将0.1 mL供试菌液加到平皿上均匀涂布。用无菌镊子夹取浸透药液的滤纸片贴在含菌平板上，每平皿放4片，其中3片为药剂，1片为只用溶剂的空白对照组。每种药液做3次重复。细菌放在37 ℃培养箱、霉菌放在28 ℃培养箱培养〔3〕。记录每皿抑菌圈的直径的平均值作为结果分析。数据采用SPSS软件处理分析，图采用EXCEL软件制作。

3 结果与分析

3.1 浸泡方式及溶剂对抑菌性的影响

以金黄色葡萄球菌为涂布菌种，以无菌水、75%乙醇、5%、7.5%、10%醋酸分别作为溶剂、制成含生药0.02 g/ml的单味药浸泡液和八种药物按A比例混合浸泡液。结果显示，以单味药剂单独浸泡与八味药混合后浸泡的抑菌性有显著差异，P<0.001。每个单味药用无菌水浸泡，均无抑菌性，而将八味药混合后用无菌水浸泡则有抑菌性，说明中药配伍有利于药效发挥，各药相互间具有协同性。不同比例乙醇和醋酸浸泡各单味药剂都有抑菌性，但八味药剂混合药效大于各单味药效。溶剂中抑菌性：醋酸>乙醇>无菌水。醋酸为溶剂，抑菌效果好，其中10%醋酸抑菌效果最佳(如图1)。

图1 浸泡方式及不同溶剂对抑菌性影响

3.2 不同配比及浸泡温度对抑菌性的影响

以金黄色葡萄球菌悬液涂布、10%醋酸为溶剂进行浸泡，制成含生药0.02 g/ml，试验不同配比(A、B、C)及浸泡温度(20 ℃、28 ℃、36 ℃)对抑菌性的影响。结果为A配比抑菌性最佳，随着浸泡温度的提高，抑菌性也提高。故在一定范围内，适当加温，有利于药用成分的浸出(如图2)。

图2 不同配比及浸泡温度对抑菌性的影响

3.3 浸泡时间对不同菌种抑菌性的影响

以A配比，36 ℃，10%醋酸浸泡2天、5天、8天,对三种细菌和一种霉菌的抑菌性试验。结果为浸泡2天对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等细菌抑菌性较强，随着浸泡时间延长，对霉菌抑菌性增强，而对细菌抑菌性反而下降。该药剂对霉菌的抑菌效果强于对细菌的抑制作用。综合总的抑菌效果以2天抑菌效果较佳。浸泡时间过长是否影响药物稳定性而使细菌抑菌性下降，还有待研究(如图3)。

图3 浸泡时间对三种菌抑菌性影响

3.4 传统浸泡法与超声波萃取对抑菌性的影响

以A配比，10%醋酸为溶剂，36 ℃，传统浸泡2天，采用三种处理：①单味药浸泡后再按比例混合，②按比例混合再浸泡，③按比例混合后再用超声波萃取等方法获得药剂提取液，含生药0.02 g/ml，以三种细菌、青霉菌涂布平板，比较超声波萃取与传统浸泡提取液对上述菌体抑菌效果。抑菌性结果显示，单味药单独浸泡再混合<按比例混合再浸泡，中药配方混合在一起浸泡有利于药性的更好发挥，这个结论是否具有通用性或普适性还有待进一步深入探究。而最佳传统浸泡条件与超声波萃取两者差异不大。但超声波萃取时间短、操作简单、得率高等优点，故在中药提取中已被广泛应用。该药剂对霉菌的抑菌比对细菌抑菌效果好。

图4 提取方式对不同菌抑菌性的影响

3.5 生药浓度对抑菌性影响

生药浓度大小不仅影响药效，还涉及制药成本。为探究配制生药浓度对抑菌性影响，以A配比、10%醋酸为溶剂、36 ℃、传统浸泡2天，配制含生药量0.005 g/ml、0.01 g/ml、0.02 g/ml三个浓度药剂，以金黄色葡萄球菌、青霉菌悬液涂布平板。结果显示抑菌性为：0.005 g/ml<0.01 g/ml<0.02 g/ml。在一定范围内，生药浓度越大，抑菌效果越好，但制剂成本会增加，0.02 g/ml即可满足制剂需要。