脾肾阳虚证狼疮性肾炎继发骨质疏松症的代谢组学研究

刘明岭，邓日辉，徐 强，林昌松

（广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）常见的并发症[1]。随着患者生命的延长，以及长期应用糖皮质激素、免疫抑制剂，骨质疏松症（osteoporosis，OP）的发病率逐渐上升，严重影响患者生活质量，成为SLE的十大重要挑战之一[2]。因此，临床医生应关注LN继发的OP。前期临床研究表明，脾肾阳虚证是LN继发OP的常见证型。然而中医证型缺乏客观标志物，为寻找LN继发OP脾肾阳虚证的生物标志物，本研究收集了LN继发OP脾肾阳虚证、非脾肾阳虚证患者的血清，以及健康自愿者的血清，采用UPOC-QTOF-MS的代谢组学方法筛选、分析各组血清中的差异离子，通过商业化软件Progenesis QI（version 2.2）和华大自主研发的代谢组学R软件metaX对质谱数据进行统计分析，并基于数据库KEGG进行代谢物鉴定、分析，最终得出LN继发OP脾肾阳虚证的可能代谢标志物。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 诊断标准LN诊断参照2009年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准[3]，经肾活检明确诊断为LN。OP的诊断标准参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准》（第3稿）[4]。脾肾阳虚证辨证标准参照《狼疮肾炎的诊断、辨证分型及疗效评定（试行方案）》中脾肾阳虚证的诊断标准[5]，主症：面浮肢肿，甚至全身浮肿，畏寒肢冷，神疲乏力，腰膝酸冷。次症：面色无华，便溏尿少，恶心呕吐。舌脉：舌淡胖，苔白，脉沉细弱。符合2项主症，或1项主症，2项次症，参考舌脉即可确定。

1.2 纳入标准（1）符合LN、OP诊断标准，辨证为脾肾阳虚证（医师要求具有主治医师及以上职称，以保证准确性）；（2）年龄18~60岁；（3）知情同意，自愿加入本研究。

1.3 排除标准（1）妊娠或哺乳期患者；（2）合并心、脑、造血系统等其他严重原发性疾病及精神病患者；（3）合并甲状腺疾病、甲状旁腺疾病、糖尿病、非骨质疏松性骨病、关节结核等；（4）严重感染等并发症或已行透析治疗的患者。

1.4 研究对象 本研究获得广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（批号：NO.K〔2020〕068）。收集2019年6月至2020年1月在广州中医药大学第一附属医院住院的LN继发OP患者。依据中医证型,将患者分为脾肾阳虚证LN继发OP组（PSYX组）与非脾肾阳虚证LN继发OP组（FPSYX组），并募集健康志愿者作为健康对照组（Health组）。

1.5 主要试剂与仪器 甲醇（Merck，批号：06035，规格：2.5L/瓶），甲酸（Dikma，批号：50144，规格：50 mL/瓶）；冷冻离心机（德国Eppendorf，型号：5430R），恒温搅拌器（中国Biocomma，型号：BC1000），Waters 2D UPLC（英国Waters，型号：ACQUITY UPLCI-Class 2D），高分辨质谱仪（英国Waters，型号：Xevo G2-XS QTOF），ACQUITY UPLC BEH C18 column（英国Waters，型号：3173810125135），水液净化系统（美国Millipore Corporation，型号：Milli-Q Integral），冷冻真空浓缩机（丹麦Labogene，型号：MaxiVacbeta），液相色谱仪（英国Waters，型号：2777C UPLC system）。

1.6 观察指标 收集研究对象的一般资料，包括年龄、性别、病程、骨折病史、股骨头坏死病史，以及糖皮质激素、免疫抑制剂、钙剂、维生素D、双膦酸盐使用史；检测腰椎及髋部骨密度；分析患者中医证型。所有研究对象均在07：00:00空腹抽取静脉血4 mL。置于肝素化的EP管中，离心10 min（10 000 g，4℃），分离上层血清，置于干净的2 mL EP管中，储存于-80℃冰箱中备检。

1.7 检测方法 代谢物提取、检测方法步骤见图1。

图1 实验流程图

1.7.1 色谱条件 采用ACQUITY UPLC BEH C18column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，UK)进行色谱分离，色谱柱柱温为50℃，流速为0.4 mL/min,其中A流动相为水和0.1%甲酸，B流动相为甲醇和0.1%甲酸。对代谢物采用以下梯度进行洗脱：0～2 min,100%流动相A；2～11 min，0%～100%流动相B；11～13 min，100%流动相B；13～15 min，0%～100%流动相A。每个样本的上样体积为5 μL。

1.7.2 质谱条件 利用高分辨串联质谱Xevo G2-XS QTOF（Waters，UK）分别进行正负离子模式采集，从色谱柱上洗脱下来的小分子。正离子模式下，毛细管电压和锥孔电压分别为3.0 kV和40.0 V。负离子模式下，毛细管电压及锥孔电压分别为2.0 kV和40.0 V。采用MSE模式进行Centroid数据采集，一级扫描范围为50～1 200 Da，扫描时间为0.2 s，对所有先驱离子按照20 eV到40 eV的能量进行碎裂，采集所有的碎片信息，扫描时间为0.2 s。在数据采集过程中，对LE信号每3 s进行实时质量校正。同时，每隔10个样本进行一次混合后质控样本的采集，用于评估在样本采集过程中仪器状态的稳定性。

1.8 数据分析及统计学方法 临床数据分析采用SPSS 25.0统计软件，计量资料采用“中位数（四分位间距）”[M（P25，P75）]表示。不符合正态分布的计量资料采用非参数检验，计数资料采用χ2检验。实验数据使用软件MassLynx4.1（Waters，UK）进行分析，峰提取主要通过商业软件Progenesis QI（version 2.2）（来源：Thermo Fisher Scientific,USA）实现，包括峰对齐、峰提取、归一化、去卷积和化合物鉴定等步骤。质量控制-局部多项式回归拟合信号校正，得到的数据采用多变量PLS-DA模型前两个主成分的VIP值，结合单变量分析差异倍数（fold-change）和t检验的P值来筛选差异表达的代谢物。筛选条件[6]:（1）VIP≥1；（2）fold-change≥1.2或者≤0.8333；（3）P＜0.05。三者取交集，得到共有的离子即差异离子。代谢通路分析基于数据库KEGG、HMDB。

代谢组学数据分析软件metaX（版本：1.0.3，来源：Beijing Genomics Institute,CN）[7]，可进行单变量和多变量分析，从而获得组间差异代谢物，组间比较采用t检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象基本情况 非脾肾阳虚证包括热毒炽盛证1例，肝肾阴虚证3例，气阴两虚证2例。PSYX组与FPSYX组的各项临床资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。3组均为女5人，男1人，在年龄、病程、骨折史、股骨头坏死史方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。PSYX组、FPSYX组骨密度明显低于Health组（P＜0.01）。（见表1）

表1 研究对象一般资料

2.2 质量控制结果 质量控制的离子流图表明，仪器的稳定性良好。（见图2）

图2 QC样本TIC重叠图

2.3 单变量分析 采用t检验和变异倍数分析。在统计分析过程中，进一步统计检验得到P值。最终结果以火山图形式呈现差异倍数（Fold change）和P值两个指标，通常以差异倍数≥1.2或≤0.833 3，P＜0.05作为筛选差异代谢物的条件。结果表明FPSYX组与Health组的差异代谢物较多，而PSYX组与FPSYX组的差异代谢物明显减少。（见图3）。

图3 组间比较单变量分析火山图

2.4 多变量分析

2.4.1 主成分分析PCA主要用于观察实验模型中的组间分离趋势，以及是否有异常点出现，同时从原始数据上反映组间和组内的变异度。结果表明FPSYX组的离散较大，说明该组受试者的代谢物差异较大，而PSYX组与Health组较集中。（见图4）。

图4 组间比较PCA模型图

2.4.2 PLS-DA分析 使用metaX软件建立每两个组之间的PLS-DA模型，若模型参数（R2和Q2）值较高，则当前PLS-DA模型较为可靠，同时对该模型参数R2和Q2进行置换检验，次数为200次。组间两两比较结果表明，与Health组比较，PSYX组与FPSYX组的R2和Q2值均较高，代谢物差异较大。而与FPSYX组比较，PSYX组的R2和Q2值均较低，代谢物差异较小。（见图5）3组间比较，R2和Q2值较高，代谢物差异较大。（见图6）

图5 组间两两比较的PLS-DA图

图6 3组间比较的PLS-DA图

2.5 鉴定到的差异 生物标志物基于数据库HMDB、KEGG分析，与FPSYX组、Health组比较，PSYX组的N-（1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基）羟胺、10-氧-11，15-植物二烯酸、2，3-二诺-8-异前列腺素上调，9，10-环氧十八碳三烯酸醚烯酸、烯二酸、脱镁叶绿酸盐A、根霉素b、磷酸-大麻素、16α-羟雌酮、2-羟雌酮、16-葡萄糖醛酸-雌三醇、1α，25双羟维生素D3、反式-3-氯-2-丙烯-1-醇下调。这些差异代谢物与化学致癌作用，α-亚麻酸代谢，逆行内源性大麻素信号通路，激素的生物合成，氯代烷烃和氯代烯的降解等多个代谢通路相关。差异离子及鉴定结果见表2。

表2 鉴定的生物标志物及代谢通路

对筛选出来的差异离子进行聚类分析，用热图形式呈现。相对于整体水平，FPSYX组Phospho-anandamide水平升高，PSYX组trans-3-Chloro-2-propene-1-ol、1alpha,25-Dihydroxyvitamin D3、Rhizocticin B、Pheophorbide a、2-Hydroxyestrone水平降低。Health组2,3-Dinor-8-iso prostaglandin F1alpha水平降低，Pheophorbide a水平升高。（见图7）

图7 样品生物标志物归一化峰面积的热图和聚类图

3 讨 论

LN目前尚无对应的中医病名，根据水肿、蛋白尿、管型尿、脓尿、少尿或无尿等主要临床表现，LN可归属于中医学中“水肿”“尿浊”“隆闭”“虚劳”等范畴。LN病因复杂，可分为内因、外因。内因主要是先天禀赋不足、后天失调、劳累过度或七情所伤，外因主要是外感风寒湿热之邪，气血、经络不通，日久及肾。叶任高、孙伟均认为其病机以肾虚、瘀、热、毒为主，其中以肾虚为本，与阴虚关系最为密切，瘀、热、毒为标[8-9]。随着疾病的发展，又变生出湿浊、溺毒等病理产物，日久可形成气阴两虚、脾肾气（阳）虚等证候。阴虚、热毒、湿热、瘀血是本病的病机关键。

脾为后天之本，气血生化之源；肾为先天之本，藏精主骨生髓，骨的生长发育依赖气血、肾精的滋养。脾阳虚，则水谷精微化生不足，肾阳不足，精不化气，则导致骨骼失养，骨枯不荣，发为“骨痿”，即OP的发生。陈喆[10]采用补脾益肾法治疗脾肾阳虚证骨质疏松症患者，发现不仅可以改善症状，而且可以提高骨密度，从而证实了脾肾阳虚是OP的重要病机。

本研究是在前期LN继发OP相关证候临床研究的基础上进一步开展的研究。本团队前期统计了66例LN继发OP患者的中医证型，脾肾阳虚证占83.33%（55/66）。

本研究通过高通量代谢组学分析LN继发OP脾肾阳虚证的生物标志物，发现了多种内源性代谢物质发生改变，涉及激素合成、代谢物降解等多个通路，与炎症、损伤、免疫紊乱、骨细胞及骨代谢异常、肠道菌群失调有关，揭示了LN继发OP脾肾阳虚证可能的物质基础。

N-（1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基）羟胺，即PhIP，是一种致癌杂环芳香胺，对心、肺、肝、肾蛋白质有氧化损伤[11]和化学致癌作用[12]。α-亚麻酸摄入量与骨密度呈正相关[13]，在人体内还可发挥抗炎、调节免疫的作用[14]。反式-3-氯-2-丙烯-1-醇属于氯代烷烃和氯代烯的降解物质，与菌群调节有密切关系[15-16]。研究提示PSYX组患者该物质明显上调，可引起肾损伤，导致肾性骨病；α-亚麻酸下调，降低骨密度，导致炎症、免疫失调。PhIP属“浊物”，应排泄出去，而α-亚麻酸属于“精微物质”，应吸收。反式-3-氯-2-丙烯-1-醇可理解为“脾气”“脾阳”的功能反应。因脾阳虚，“升清降浊”功能下降，导致清者不升，浊者不降。因此，PhIP上调，α-亚麻酸、反式-3-氯-2-丙烯-1-醇下调可能是脾阳虚衰的生物标志物。2,3-二诺-8-异前列腺素是花生四烯酸代谢通路中重要的炎症介质，有促进或抑制骨与软骨代谢的作用[17]。ZHANG A H等[18]应用UPLC/MS方法探讨了去卵巢骨质疏松大鼠的生物标志物，发现花生四烯酸代谢等10种生物标志物显著上调。脱镁叶绿酸A是卟啉的衍生物，其和紫红素18的氯素大环可结合重组RANKL，抑制RANK-RANKL相互作用，抑制RANKL依赖的模型细胞激活和RANK表达前体向破骨细胞分化[19]，从而起到抗骨质疏松的作用。本研究提示，脾肾阳虚证和非脾肾阳虚证LN继发OP患者，2,3-二诺-8-异前列腺素明显上调，脱镁叶绿酸A显著下调，提示这2种物质可能是LN继发OP的重要生物标志物。

雌激素（16α-羟雌酮、2-羟雌酮、16-葡萄糖醛酸-雌三醇）及1α,25双羟维生素D3在骨代谢中扮演重要角色。2-羟雌酮、16α-羟雌酮、雌三醇均可增加骨量，提高骨密度，防止骨质疏松的发生[20-22]。1α,25双羟维生素D3是人体所必需的活性维生素D3，可通过调节钙磷代谢，促进成骨样细胞活性和骨形成蛋白合成，调节OPG、RANKL的表达[23]，从而提高骨密度。雌激素、1α，25双羟维生素D3的作用与中医学中“天癸”“肾气”的作用相似，均为肾所主。研究提示PSYX组的上述激素水平明显下调，考虑与肾阳虚衰有密切关系，可能是肾阳虚的生物标志物。杨新军[24]发现绝经后脾肾阳虚证OP患者血清25-OHD3水平显著降低，与本研究较一致。

本研究属非靶向高通量代谢组学分析，所检测出的离子众多，虽经不断筛选、对比鉴定、分析，但只能判定潜在分子标志物，尚需靶向分析验证。此外，本研究结果也存在大量无法分析的分子，具体通路和作用无法得知。由于本研究的样本量小，未必能代表整体，下一步将扩大检测样本量，减小偏倚。