化妆品中金黄色葡萄球菌检测能力验证结果与分析

马冉 雷柳冰 李发俊

（东莞市食品药品检验所 广东东莞 523808）

1 前言

金黄色葡萄球菌是一种重要病原菌，在自然环境中分布广泛，抵抗力强。其与人体肌肤的小伤口接触，可能引起局部化脓性病灶，严重时能够引起败血症[1]。化妆品内因为含有多种营养成分，细菌容易繁殖，从而受到污染。《化妆品卫生规范》（2015年版）中对于金黄色葡萄球菌的规定是不得检出[2]。

能力验证是实验室技术能力的考核指标，其与现场评审考核共同构成能力评价体系[3-4]。通过能力验证，可以加强化妆品中致病菌的检测能力，提高实验室对金黄色葡萄球菌的检验鉴定水平，加强内部质量控制水平[5]。2019年，本实验室参加了化妆品中金黄色葡萄球菌检验能力验证（编号NIFDC-PT-188，中国食品药品检定研究院）。采用VITEK2 Compact、BaxQ7全自动病原菌检测系统和国标法3种检测方法，通过进行3种可选方法的对比，评价不同方法的适用范围，建立本实验室化妆品微生物检测规范，以提高本实验室的微生物检测能力。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品

NIFDC-PT-188化妆品能力验证样本（编号为TC01880147和TC01880179，中国食品药品检定研究院）。样品存放于西林瓶中，2支西林瓶中各有1小团粉底膏包裹的1个白色冻干菌球。

2.1.2 培养基和试剂

大豆酪蛋白葡萄糖卵磷酯吐温80（SCDLP）液体培养基（广东环凯）；Baird Parker琼脂基础（广东环凯）；金黄色葡萄球菌显色平板（广东环凯）；BHI肉汤（广东环凯）；血琼脂平板（广东环凯）；冻干兔血浆（广东环凯）。革兰阳性细菌鉴定卡（法国梅里埃）；金黄色葡萄球菌实时荧光PCR检测试剂盒（美国杜邦）。

2.1.3 标准菌株

金黄色葡萄球菌（编号CMCC26003）；表皮葡萄球菌（编号CMCC223011）。

2.1.4 仪器设备

压力蒸汽灭菌锅（日本三菱）；生物安全柜（苏净安泰）；生化培养箱 （宾得）；漩涡震荡器（IKA）；VITEK2 Compact全自动微生物鉴定仪（梅里埃）；BaxQ7全自动病原微生物快速检测系（美国杜邦）；生物显微镜（奥林巴斯）。

2.2 检验方法

按照2019年NIFDC-PT-188能力验证作业指导书以及《化妆品安全技术规范》（2015版）[2]的要求，进行增菌、分离和鉴定。同时用进行快速筛查法（BaxQ7实时荧光PCR）和全自动生化仪鉴定法（VITEK2 Compact）进行菌株鉴定，综合试验结果并出具检验报告。实验阳性对照：金黄色葡萄球菌；实验阴性对照：表皮葡萄球菌。

2.2.1 国标法

2.2.1.1 样品前处理及增菌

按照样品作业指导书的前处理要求进行样品前处理。步骤如下：在生物安全柜中打开样品瓶，每支瓶中加入6 mL SCDLP液体培养基，用震荡仪将样本完全震荡混匀，使粉底膏彻底分散；再将其转移至无菌三角瓶中，用1 mL的SCDLP润洗西林瓶，共4次；最后加入SCDLP至100 ml作为样品溶液。取阳性菌液1 mL（金黄色葡萄球菌，100CFU以内）接种至10 mL的SCDLP中作为阳性对照，另取10 mL SCDLP培养基作单独作为阴性对照。将上述样本培养液、阳性对照和阴性对照置于36℃培养24 h。

2.2.1.2 分离培养

将上述增菌后的培养液，分别接种于BP平板、血平板和金黄色葡萄球菌显色培养基中，于36℃培养24 h。

2.2.1.3 纯化培养

按照分离平板说明书描述可疑菌落特征，挑取疑似菌落分别接种于BHI培养基和胰酪大豆胨琼脂平板上，于36℃培养24 h。

2.2.1.4 染色镜检

挑取纯化的可疑菌落，涂片，革兰氏族染色后镜检。

2.2.1.5 血浆凝固酶试验

按血浆凝固酶试剂的说明书步骤操作。向瓶中加入0.5 mL生理盐水，再加入0.3 ml新鲜的肉汤培养物，混匀后置于36℃培养箱中，6 h之内呈现凝固状态判断为阳性。按说明书要求同时做阳性和阴性对照试验。

2.2.2 BaxQ7实时荧光PCR扩增

按商业化耗材说明书进行取样和处理。取“2.2.1.1”中的增菌液5μL，同时加入裂解液200μL，采用阳性菌裂解程序，金属浴中55℃裂解1 h，95℃保持10 min，随后4℃冷却5 min。从裂解管中取出50μL加入试剂条中，上机，选定金黄色葡萄球菌实时荧光PCR的程序运行。90 min后查看结果。

2.2.3 VITEK2Compact鉴定

挑取“2.2.1.3”中的纯化复壮后的单个菌落，按照全自动微生物鉴定仪器说明书要求，配置相应浓度的细菌悬液，随后接种阳性鉴定卡，上机进行测试，约8～10 h后查看结果。

3 结果与分析

3.1 国标法

样品TC01880147在BP平板、血平板和显色平板上均分离出2种菌落，但与金黄色葡萄球菌有明显区别，判定未检出目标菌落。样品TC01880179在3种平板上均有2种菌落，有1种菌落特征与金黄色葡萄球菌阳性菌落相同，而且血浆凝固酶试验呈阳性，镜检为革兰氏阳性球菌，判定检出目标菌落。具体菌落形态见表1，后续生化反应和镜检结果见表2。

表1 菌落平板形态

表2 国标法试验结果

3.2 BaxQ7实时荧光PCR扩增

样品达到荧光值阈值的循环数（Ct值）详见表3，PCR扩增曲线详见图1。由表3和图1可以看出，样品TC01880147未检出目标菌，样品TC01880179检出，这与国标法判定的检测结果一致。

表3 样品的Ct值

图1 BaxQ7实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌扩增结果

3.3 VITEK2Compact

3种分离平板上的所有菌落，Vitek鉴定结果见表4。由此可知，样品TC01880147未检出金黄色葡萄球菌，样品内含有3种干扰菌落，分别是表皮葡萄球菌、人球葡萄球菌和英诺克李斯特菌。样品TC01880179检出金黄色葡萄球菌，同时含有英诺克李斯特菌作为干扰菌。

表4 VITEK2 Compact鉴定结果

3.4 3种方法对比

本次能力验证中，使用仪器BaxQ7和VITEK2 Compact的结果与化妆品卫生规范的传统方法检出结果一致，3种检测结果见表5。

表5 3种方法鉴定结果

4 讨论

检验机构的检测能力是评价实验室能力的重要条件[6]。为加强药品化妆品微生物检测质量的控制，提高微生物检测能力，本实验室参加了此次能力验证。

能力验证中首先参考国家法定标准方法，即GB 4789.10-2016金黄色葡萄球菌检测方法[7]。样品前处理采用漩涡震荡的方法来分散样品，除常规检验使用的BP平板和血平板外，根据相关文献报道[8-10]，在金黄色葡萄球菌显色培养基中，加入金黄色葡萄球菌的特征性酶的显色底物，其灵敏度和特异性较标准方法高，因此本次能力验证选择显色培养基作为测试和补充。从对目标菌和干扰菌的分离选择作用来看，BP板和显色平板无明显差异，与林碧莲[11]报道的结果一致。

本次能力验证中，使用仪器BaxQ7和VITEK2 Compact的结果与化妆品卫生规范的传统方法检出结果一致。实验室日常检测大多运用国标法，结果准确稳定，但是检验步骤较为烦琐、耗时较长。BaxQ7系统属于快速筛查方法，原理基于实时荧光定量PCR技术直接检测目标微生物的特征基因片段。样本增菌后，使用整合了荧光探针、DNA聚合酶、引物、dNTP以及缓冲体系的商业化试剂，其检出限在1～10 cfu/g，与传统方法相比，用来检测金葡菌可以节省4～6 h[12-13]。BaxQ7系统同时具有操作简便和实现高通量筛选的特点，特别适用于大批量样品的快速应急检验[15-16]。

能力验证样品中有目标菌金黄色葡萄球菌和相似的干扰菌。传统的国标方法只是针对目标菌的生化检验，缺乏对干扰菌的检验方法。而VITEK2Compact将29种生化反应集中于一张卡片上，全程自动化培养和判定生化结果，还能够将生化结果与数据库进行比对得出结论。对于疑似菌、未知菌的鉴定具有高能量、快速便捷的特点[17]。

在日常的检验工作中，BAxQ7系统和VITEK2 Compact系统不能作为报告依据，因而不能完全代替传统国家标准方法，但可以将3种方法相结合，突破传统化妆品检验方法的局限性，提高化妆品检验的效率和能力。