化妆品中耐热大肠菌群检验能力的验证结果与分析

范月娜

（广东省清远市食品药品检验所 广东清远 511500）

1 前言

耐热大肠菌群也称为粪大肠菌群，与大肠菌群一样，它们不是细菌学分类名词，而是卫生细菌领域用语，不代表某一个或某一属细菌，而指的是某一类细菌。大肠菌群是指具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，是需氧及兼性厌氧、在35℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。耐热大肠菌群最初被定义为大肠菌群的一个子集，不同点在于它在较高的培养温度（44.5℃）下生长并发酵乳糖。通常情况下，耐热大肠菌与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，其存在可认为被测物直接或间接受到了比较近期的粪便污染，受肠道致病菌污染的可能性更大[1-3]。因此，化妆品中耐热大肠菌群的检测具有重要意义。

为提高耐热大肠菌群的检验能力，加强实验操作能力，本实验室参加了2020年中国食品药品检定研究院组织的NIFDC-PT-261《化妆品耐热大肠菌群检验》能力验证。本文通过对此次能力验证的结果进行分析讨论，总结实验过程中的经验，以期为微生物检验工作提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 培养基与试剂

双倍乳糖胆盐 （含中和剂）培养基 （批号：1094291）、伊红美蓝琼脂（批号：1087421）、肠杆菌显色培养基（批号：1086191）、革兰氏染色液（批号：6106060），均购自环凯微生物；靛基质试剂（批号：200315），均购自北京三药科技开发公司。

2.1.2 仪器设备

SQ510C高压灭菌锅（日本雅马拓公司）；AC2-4S1型生物安全柜（新加坡易思高公司）；LRH-250A生化培养箱（35℃，广东省医疗器械厂）；LRH-250A生化培养箱（44.5℃，韶关市泰宏医疗器械有限公司）。

2.1.3 样品

中国食品药品检定研究院提供的NIFDC-PT-261化妆品能力验证样品2份，编号分别为TC0261 0023、TC02610087。每份样品为西林瓶装的1个白色菌球及膏状粉底基质，基质含量1g/瓶。

2.1.4 菌种

大肠埃希菌（CMCC44102）（中国食品药品检定研究院）

2.2 方法

按照NIFDC-PT-261《化妆品耐热大肠菌群检验》能力验证作业指导书进行样品前处理，根据《化妆品安全技术规范》（2015年版）进行培养鉴定，综合实验结果出具检验报告。

2.2.1 样品前处理

在生物安全柜中进行实验操作，打开样品西林瓶，分别加入5 mL灭菌生理盐水将样品完全溶解并混匀，转移至灭菌试管中，之后再用灭菌生理盐水润洗西林瓶2次，每次1mL，最终试管中灭菌生理盐水体积为10 mL，此时样品为1∶10稀释样品液。

2.2.2 乳糖发酵培养

取10 mL制备好的1∶10样品液，加至10 mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，于培养箱中44℃培养24h，如既不产酸也不产气，则继续培养至48h。

2.2.3 分离培养

如产酸产气，则分别划线接种至伊红美蓝培养基（EMB）和大肠菌群大肠杆菌显色培养基上，36℃条件下培养24 h。

2.2.4 鉴定试验

染色镜检：分别挑取分纯菌落，涂片，革兰氏染色，镜检。

靛基质试验：（1）取2.2.2的双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养液1～2滴，接种至蛋白胨水中，44℃条件下培养24 h，加入靛基质试剂约0.5 mL，观察靛基质反应。（2）在大肠菌群大肠杆菌显色培养基的目标菌落上，滴加1滴靛基质试剂，观察菌落边缘颜色。

3 结果与分析

3.1 乳糖发酵结果

将样品TC02610023在44.5℃条件下培养24 h，如既不产酸也不产气，则继续培养至48 h，若仍不产酸不产气，则直接判定为耐热大肠菌群阴性。样本TC02610087和阳性对照在44.5℃条件下培养24 h，若培养基颜色变黄，小导管有气体产生，则可判断为产酸产气，进行下一步分离培养。

3.2 菌落特征

样品划线接种在EMB平板和显色上的菌落形态见表1，可知样本TC02610087在2种平板上呈现的菌落典型，与阳性对照一致，可进行进一步生化鉴定。

表1 分离培养结果

3.3 生化鉴定

挑取典型菌落进行生化鉴定，实验结果如表2。样品在2种平板上的典型菌落均为革兰氏阴性短杆菌，且蛋白胨水和显色平板菌落上的靛基质试验都为阳性，可以判断样品TC02610087检出耐热大肠菌群。

表2 生化鉴定结果

4 讨论

能力验证是实验室考察自身检验能力和水平的重要方式，可以帮助实验室查漏补缺，及时纠正检验系统中的偏差，提升实验室整体的检验水平[4-5]。本次能力验证取得满意结果，通过对实验过程进行总结分析，得出的经验是除应当严格按照作业指导书和检验标准操作外，还需要做好以下3项工作：

（1）确保试管等试验器具均被清洗干净。因为双倍乳糖胆盐培养基里面的溴甲酚紫，其pH变色范围为5.2（黄色）～6.8（紫色），如试管没有清洗干净而残留酸，就会使双倍乳糖胆盐变黄色，从而造成假阳性。但要注意，如果灭菌后装双倍乳糖胆盐的试管底部出现一点点黄色物质，则是中和剂在高温灭菌时析出而沉降至底部，并不影响使用。

（2）同步进行阳性对照试验。微生物检验通常需要依赖检验人员的经验水平，主观性较强，特别是在分离平板上的菌落辨别和挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检，易造成因经验不足而出现假阴性[6]。同步进行阳性对照试验，就能准确把握目标菌落的形态特征。因耐热大肠菌群主要是由大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）组成的[7]，因此用其作为阳性对照菌。

（3）采用多种分离鉴定方法相互印证结果。相较于PCR检测仪、全自动生化鉴定仪等高端设备，显色培养基是最经济方便且有效可靠的手段[8-10]。大肠杆菌显色培养基使目标菌落呈现出特有的蓝绿色，而其他杂菌则呈现出完全不同的颜色，菌落识别一目了然，挑取目标菌落的成功率大为提高。而且在显色平板上的大肠杆菌菌落可以直接进行靛基质试验，菌落边缘会变红。