青海不同产地宽叶羌活抗菌活性的筛选及活性比较

李美雎，朱瑞娟，陈海娟，尚 军

(青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008)

羌活为伞形科羌活属的宽叶羌活(Notopterygiumfranchetii)或羌活(Notopterygiumincisum)的干燥根茎和根。宽叶羌活药性温，微苦、辛，归膀胱、肾经。具有祛风、散寒的功效，主治外感风寒、头痛无汗、风寒湿痹、项强筋急、肩臂酸痛、痈疽疮毒等症。主产于四川、甘肃、青海、西藏、陕西、新疆、云南等地。宽叶羌活喜阴冷湿润气候，怕强光，生长于海拔2 000～4 000 m的林缘、灌丛下、沟谷草丛中。宽叶羌活的化学成分中主要有挥发油、香豆素及糖类、有机酸、氨基酸等[1～3]。文献研究报道[4]，采用高效液相色谱测定羌活中羌活醇、异欧前胡素的含量和薄层鉴别色谱法鉴别中药羌活中紫花前胡苷的方法，能够有效地控制中药羌活的质量。宽叶羌活的药理学研究表明，宽叶羌活有明显的抗菌、抗炎、镇痛、解热、抗氧化、抗心律失常、抗血栓形成、抗心肌缺血、促进脑循环等药理作用[5～8]。文献研究报道羌活提取物对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，并筛选出两个抗菌活性成分镰叶芹二醇(falcarindiol)和苯乙基阿魏酸酯(phenethylferulate)[9～13]。

本实验结合体外抗菌试验，筛选出羌活抗菌活性部位[14]，且以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、产气杆菌(Enterobacteraerogenes)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、变形杆菌(Proteusvulgaris)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)评价不同产地宽叶羌活抗菌活性，以此为宽叶羌活抗菌活性药物开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与药材来源 6种宽叶羌活药材均采挖于青海省不同的地方，分别为互助北山、佑宁寺、果洛玛可河、帮菜、军功、湟中。药材粉碎后过60目筛，密闭保存备用；阳性药物青霉素钠购买于中诺药业(石家庄)有限公司；试验用培养基购买于北京奥波星生物技术有限责任公司。

1.1.2 实验试剂 乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亚砜(DMSO)均为分析纯，超纯水。

1.1.3 实验菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)

产气杆菌(Enterobacteraerogenes)

大肠埃希菌(Escherichiacoli)

变形杆菌(Proteusvulgaris)

阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)

粪肠球菌(CoprococcusHoldemanandMoore)

以上7株用于活性部位的筛选和抗菌活性比较的指示菌均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，于零下20摄氏度冰箱冻存，实验前3～4 h复活使用。

1.1.4 实验仪器 电子天平METTLER TOLEDO (XP205 DeltaRange)；

电热恒温培养箱；

可调微量移液器(1 000 μL、200 μL、50μL)；

超声波清洗器SB-5200TDT(功率300W，频率40kHZ)；

高压灭菌锅、无菌操作台、离心机。

1.2 方法

1.2.1 宽叶羌活提取物的制备 取宽叶羌活药材粉末(过60目筛)50 g，置500 mL圆底烧瓶中，加入400 mL无水乙醇经超声处理(功率300 W，频率40 kHZ)回流提取2 h，共3次，过滤，合并提取液后浓缩获得羌活粗提取物浸膏，加超纯水打成混悬液，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(分析纯)萃取，浓缩得宽叶羌活各提取物浸膏，将各提取物放于恒温烘箱或干燥器内保存，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称定各宽叶羌活提取物，加入1 mL二甲基亚砜超声溶解，摇匀，精密量取0.2 mL置于10mL容量瓶中，加25%的二甲基亚砜定容至刻度，即得供试品溶液。

1.2.3 阳性对照药溶液的制备 于青霉素钠(80万单位)瓶中注入4 mL25%的二甲基亚砜，溶解、摇匀，取1 mL溶液置于5 mL容量瓶中，用4 mL25%的二甲基亚砜溶液定容，即得青霉素钠为5万单位的对照品溶液。

1.2.4 菌悬液的配置 将保存的实验菌种活化后，加入超纯水轻轻刮下菌苔并按菌液与超纯水1∶9的比率稀释成104倍，即得菌悬液，备用。

1.2.5 抑菌活性考察

(1)给药方案及分组

空白组加入240 μL25%二甲基亚砜溶液；阳性药组加入240 μL5万单位青霉素钠；实验组加入240 μL宽叶羌活不同部位供试品溶液。每组设3个平行组，重复3次。

(2)抑菌活性部位筛选及比较

在超净工作台上于无菌条件下，用牛津杯法(琼脂孔洞法)考察培养基中羌活不同部位抗菌活性，于培养箱中培养16～18 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录数据，考察不同产地羌活抑菌活性。

1.2.6 数据处理 数据处理采用SPSS17.0进行方差分析，数据以x±s表示(此公式表示数值偏差平均数的变动范围，其中x表示平均数，s表示方差)。

2 结果

由表1可知，宽叶羌活5个活性部位对粪肠球菌和大肠杆菌均表现出较强的抗菌效应，与空白对照组相比除了石油醚和水层对粪肠球菌抗菌效应差异不显著外，其它部位差异有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组相比除了正丁醇和水层对大肠肝菌抗菌效应差异不显著外，其它部位差异有统计学意义(P<0.01)；且不同部位间的抗菌效应强弱不同，其中石油醚对粪球菌抑菌效应差异不显著；水层部位对大肠杆菌抑菌效应差异不显著；氯仿部位与其他4个部位相比，对两种菌的抑菌效应均较强，故选取氯仿部位作为宽叶羌活抑菌活性部位。

表1 宽叶羌活不同部位的抑菌作用

由表2可知，不同产地宽叶羌活对受试菌均表现出一定的抗菌活性，军功帮菜、湟中、互助佑宁寺产宽叶羌活与空白组相比均有统计学意义(P<0.05或0.01)；果洛军功宽叶羌活对变形杆菌的抑菌效应无统计学意义，互助北山、果洛玛可河产宽叶羌活对铜绿假单胞菌的抑菌效应无统计学意义，对其它菌的抑菌效应均具有统计学意义(P<0.05或0.01)。

表2 不同产地宽叶羌活抑菌作用比较

由表3可知，对阴沟肠杆菌抗菌效应最强的是玛可河产宽叶羌活，与佑宁寺产宽叶羌活差异显著(P<0.05)，与其他地区产宽叶羌活氯仿部位相比差异不显著；对大肠杆菌抗菌效应最强的是佑宁寺产宽叶羌活，与军功帮菜和果洛军功产宽叶羌活差异不显著，与其他地区产宽叶羌活相比差异均显著(P<0.01)；对产气杆菌抗菌效应最强的是果洛军功产宽叶羌活，与其它产地差别不显著；对变形杆菌抗菌效应最强的是玛可河产宽叶羌活，与互助北山佑宁寺、军功帮菜产宽叶羌活差异不显著，与湟中、果洛军功产宽叶羌活差异显著(P<0.01)；对粪肠球菌抗菌效应最强的是玛可河产宽叶羌活，与其它产地差别不显著；对铜绿假单胞菌抗菌效应最强的是果洛军功产宽叶羌活，与互助北山、玛可河产宽叶羌活相比差异显著(P<0.05)，与其它地区产宽叶羌活均无显著性差异；对金黄色葡萄球菌抗菌效应最强的是帮菜产宽叶羌活，与湟中、玛可河、果洛军功产宽叶羌活差异不显著，与其他产地宽叶羌活差异显著(P<0.05或P<0.01)。

表3 不同产地宽叶羌活抑菌作用效应比较

3 讨论

随着青霉素和磺胺类药物在临床上的广泛使用，各种感染性疾病得到治疗，但是细菌对抗菌药物产生耐药性的问题也越来越明显，严重威胁人体健康。中药发展几千年的实践经验证明有许多中药都具有抗菌活性、且副作用小、很少产生耐药性等特点。有研究报道，复方川紫方具有抗菌消炎、通络止痛、行气活血散瘀等功能，由川芎、紫草、羌活等十余味药组成[15]。实验结果表明：宽叶羌活不同部位抗菌效应氯仿部位是最好的，水层部位效果不明显，说明宽叶羌活的抗菌效应对活性部位的选择具有科学性。其中，玛可河产宽叶羌活对阴沟肠杆菌、变形杆菌、粪肠球菌抗菌效应最强；佑宁寺产宽叶羌活对大肠杆菌抗菌效应最强；果洛军功产宽叶羌活对产气杆菌、铜绿假单胞菌抗菌效应最强；帮菜产宽叶羌活对金黄色葡萄球菌抗菌效应最强。且不同产地宽叶羌活对胆囊炎相关菌呈现出一个综合性效应。

宽叶羌活氯仿活性部位具有广谱抗菌效应，可作为宽叶羌活抗菌药物开发物质基础，但由于本实验采用人体给药最大剂量换算为体外给药剂量，所以关于宽叶羌活氯仿活性部位量效关系还有待于进一步研究。