蛇伤胶囊中5种蒽醌类化合物含量的测定

张 华，于虹敏，严国鸿，孙承韬

蛇伤胶囊中5种蒽醌类化合物含量的测定

*张 华1，于虹敏1，严国鸿2，孙承韬1

（1.福建中医药大学药学院，福建，福州 350122；2. 福建中医药大学附属人民医院，福建，福州 350004）

建立蛇伤胶囊中5种蒽醌类成分含量测定分析方法，提升蛇伤胶囊质量标准。采用Diamonsil C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm），流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～7 min，75%A；7～30 min，75%A→90 %A；30～40 min，90 %A），流速为1.0 mL•min-1，检测波长为254 nm，进样量10 μL。5个待测组的线性范围：4.04～40.40μg/mL（= 0.9994）、4.16～41.60μg/mL（= 0.9991）、4.14～41.40 μg/mL（= 0.9959）、4.10～41.00 μg/mL（= 0.9993）和2.16～21.60μg/mL（= 0.9997）。平均回收率（n = 6）分别为100.02%、100.02%、100.03%、99.99%和100.06%，RSD分别为0.40%、0.15 %、0.30 %、0.11 %和0.47 %。所建立的方法操作简便准确且具有良好的重复性，可用于测定蛇伤胶囊中芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的含量。

高效液相色谱法；蛇伤胶囊；蒽醌类；含量测定

福建省的气候与环境因适合蛇类生长，每年许多蛇伤患者尤其是被竹叶青蛇咬伤的患者前去医院诊治。[1-2]蛇伤胶囊为福建中医药大学附属人民医院用于治疗竹叶青蛇咬伤的常用院内制剂，主要由山慈菇、大黄、黄连、白芷、红大戟、拳参等14种中药组成，具有清热泻火、消肿止痛之功效，除了用于治疗蛇伤疗效显著外，还多用于治疗黄蜂蜇伤[3-8]。由于制剂现行质量标准较为简单，仅制剂性状、鉴别项下大黄素的薄层鉴别、检查项，为确保其临床疗效，有必要在其原有基础上进行提升。制剂处方中主要药味大黄味苦、性寒，具有泻下、清热、解毒功效，蒽醌类成分为药效物质基础。本研究采用HPLC法对蛇伤胶囊的指标性成分芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚这5种蒽醌类化合物进行含量测定，为建立蛇伤胶囊的质量标准提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（美国戴安公司，型号：Ultimate-3000型）；电子天平（梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司，型号：XS105Du）；超纯水机（密理博中国有限公司，型号：Milli-Q Advantage）。

1.2 试药

芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚标准品（批号分别为：110795-2016083、110756-201098、110757-201206、110796-201319、110758-201415，购于中国食品药品检定研究院）；蛇伤胶囊（福建中医药大学附属人民医院自制）；药材：福建承创堂提供，福建中医药大学药学院中药鉴定教研室老师鉴定，符合2015年版《中国药典》一部各药材项有关规定；其它试剂是分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序：0 ～ 7 min，75%A；7～30 min，75%A→90 %A；30 ～ 40 min，90 %A；流速：1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温：35 °C；检测波长：254 nm。

2.2 对照品溶液的制备

称取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚适量，精密称定，分别置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解、摇匀并稀释至刻度即得对照品储备液；分别吸取各对照品储备液上1 mL，混匀，即得（混合对照品中各成分浓度分别为芦荟大黄素40.4 μg/mL、大黄素41.6 μg/mL、大黄酸41.4 μg/mL、大黄酚41.0 μg/mL、大黄素甲醚21.6 μg/mL），置4 ℃保存备用。

2.3 供试品溶液的制备

称取蛇伤胶囊样品0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定，超声，静置冷却，称定，用甲醇补足失重，摇匀，滤过。精密吸取5 mL于烧瓶中，挥干，加入10 mL 8 % 盐酸溶液，超声，加入10 mL三氯甲烷，回流（90 °C、1 h），放冷，转入分液漏斗，摇匀，三氯甲烷10 mL萃取3次，合并三氯甲烷液，回收至干，加入甲醇溶解，置于10 mL容量瓶甲醇溶解，定容，即得。置4 ℃保存备用。

2.4 阴性对照溶液的制备

按制剂处方各味药材组成比例称取缺大黄的其他药材，按“2.3”项制成阴性样品对照溶液。置4 ℃保存备用。

2.5 专属性实验

精密吸取阴性对照溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，进样分析，结果显示，5种成分色谱峰峰间分离度良好，各组分色谱峰处阴性对照溶液物质和样品中其它成分对其没有干扰，此法专属性较好，结果见图1。

A：混合对照品溶液；B：供试品溶液；C：阴性对照溶液

图1 蛇伤胶囊中蒽醌类成分含量测定HPLC图谱

Fig. 1 HPLC chromatograms of anthraquinones in Sheshang capsuls

2.6 线性关系的考察

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。进样分析，以浓度为横坐标X ( mg/mL )，峰面积为纵坐标Y，进行线性回归，计算，结果见表1。5个组分在各自检测范围内与峰面积呈良好线性关系。

表1 5种蒽醌类成分线性回归方程

Table 1 The linear regression equation of 5 kinds of anthraquinones

对照品组分回归方程r 芦荟大黄素Y=653.26 X+0.17050.9994 大黄素Y=752.48 X-0.11060.9991 大黄酸Y=710.46 X-0.06690.9959 大黄酚Y=977.13 X+0.29380.9993 大黄素甲醚Y=633.88 X+0.01110.9997

2.7 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液连续进样6次，记录峰面积，结果RSD分别为0.56 %、0.66 %、0.54 %、0.60 %、0.63 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批次供试品，照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，记录峰面积，各组分的RSD分别为1.52%、2.34 %、1.63 %、1.78 %、1.75 % ( n=6 )，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

取同一批次供试品，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，计算，RSD分别为1.79 %、1.83 %、1.96 %、2.26 %、1.52 %，表明样品在24 h内稳定。

2.10 加样回收率试验

精密称取6份同一批次已知含量的蛇伤胶囊样品，分别精密加入芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚各对照品适量，按照“2.3”项下方法制备溶液，进样分析，测定各成分峰面积，计算。结果见表2。各组分平均回收率分别为100.02%、100.03%、100.02%、99.99%和100.06%，RSD分别为0.40 %、0.30%、0.15 %、0.11 %和0.47 %。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

Table 2 The results of recovery test

成分称样量/g样品含量/mg加入量/mg测定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/% 芦荟大黄素0.35068.08446.467514.515499.43100.020.40 0.35048.08106.464814.5522100.10 0.35058.08348.088416.2176100.57 0.35038.07848.074416.132299.75 0.35058.08189.698117.777699.98 0.35078.08749.704817.82001.0029 大黄酸0.350415.696612.557328.2903100.29100.030.30 0.350815.715812.572728.3375100.39 0.350415.697215.702231.350499.69 0.350515.701215.697231.361199.76 0.350415.699418.839334.5777100.21 0.350715.709218.851034.532299.85 大黄素0.350712.693610.154922.8550100.07100.020.15 0.350412.685310.148322.812599.79 0.351112.710812.715825.411499.88 0.350012.669112.665125.3566100.18 0.349712.658315.190027.8552100.05 0.351312.716415.259727.9995100.15 大黄酚0.351028.732722.986251.680699.8399.990.11 0.351028.735522.988451.7622100.17 0.351328.756528.761557.5213100.01 0.350828.715228.711257.411599.95 0.350728.710134.452163.1778100.05 0.351028.729534.475363.185199.94 大黄素甲醚0.35137.65746.125913.8319100.79100.060.47 0.35057.64036.112313.744999.87 0.34997.62797.632915.239499.72 0.35077.64617.642115.273699.81 0.35027.63359.160216.8384100.49 0.35027.63389.160616.764299.67

2.11 样品含量测定

取3份不同批次的蛇伤胶囊样品，按照“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积，计算。结果见表3。

表3 三批蛇伤胶囊样品中五种蒽醌类成分含量测定（n=3）

Table 3 The determination results of five anthraquinonests in three batches of Sheshang capsuls

批号芦荟大黄素(mg/g)大黄酸(mg/g)大黄素(mg/g)大黄酚(mg/g)大黄素甲醚(mg/g)总量(mg/g) 14031726.0743.2837.35110.7119.21236.62 14082523.0744.7936.2181.8721.79207.73 15030327.8542.9337.43107.7819.07235.06

3 讨论

福建中医药大学附属人民医院收治的蛇伤患者，有70%以上为竹叶青蛇咬伤，临床上多用蛇伤胶囊治疗，主在泻火解毒。方中大黄具有泻火、凉血、解毒之功效。黄凤等[9]探讨了《中国药典》中大黄在中药制剂的使用及其质量控制，表明153个制剂中对大黄的质量控制同时以5个成分作为评价指标的仅4个品种。蛇伤胶囊制剂的现行质量标准中未对这 5个蒽醌类成分进行质量控制。本实验以5个蒽醌类化合物为指标，考察样品提取溶剂、提取方式、提取溶剂用量[10-12]，最终确定了样品制备方法：甲醇溶液，35倍量，超声提取45 min。酸水解条件考察方面，比较不同浓度盐酸( 4 %、8 %、16 % )的水解及水解时间，结果表明水解酸浓度对大黄酸有较大影响，而其他成分没有。最终确定：8 %盐酸超声30 min。萃取溶剂选择，考察乙醚、丙酮、三氯甲烷等，结果表明，三种溶剂提取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素的能力差别不大，三氯甲烷萃取时，大黄酚、大黄素甲醚提取率较高，其他无影响，因此选择三氯甲烷为萃取溶剂。

色谱条件考察，首先进行检测波长的选择，分别考察了230、254、280 nm[13-14]对样品中5个蒽醌类成分影响，结果表明，254 nm处5个组分峰面积较大，峰型较好，无干扰。流动相的选择，考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液，实验结果显示，使用甲醇-0.1 %磷酸水溶液为流动相，待测组分的分离度较高，样品中其他杂质成分无干扰，峰型较好。

本研究建立的测定蛇伤胶囊中5种蒽醌类化合物的HPLC法含量准确，重现性好，专属性强，说明该测定方法可靠，可用于提升和完善蛇伤胶囊质量控制。

（致谢：本项目在福建省科技厅重点实验室完成。）

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DETERMINATION OF FIVE ANTHRAQUINONES IN SHESHANG CAPSULES

*ZHANG hua1, YU Hong-min1, YAN Guo-hong2, SUN Cheng-tao1

（1. Pharmacy College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China;2. People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350004, China）

To establish a quantitative determination method of HPLC for five anthraquinones and improve the quality control standard of Sheshang capsules.The separation was performed on a Diamonsil-C18column (250 mm×4.6 mm, 5µm) with a gradient elution (0-7min, 75%A; 7-30 min, 75%A→90%A; 30～40 min, 90%A) of the mobile phase composed of methanol (A) and 0.1% phosphoric acid (B). The flow rate was 1.0 mL.min-1and the detection wavelength was 254 nm. The injection volume was 10 μL.The linear ranges of five anthraquinones were 4.04 ～ 40.40 μg/mL (r = 0.9994), 4.16 ～ 41.60 μg/mL (r = 0.9991), 4.14 ～ 41.40 μg/mL (r = 0.9959), 4.10 ～ 41.00 μg/mL (r = 0.9993) and 2.16 ～ 21.60 μg/mL (r = 0.9997), respectively, and their average recoveries respectively were 100.02%, 100.02%, 100.03%, 99.99% and 100.06%, RSD respectively were 0.40 %, 0.15 %, 0.30 %, 0.11 % and 0.47 % (n=6).The established method is simple, accurate and reproducible, can be used to determine the contents of aloe emodin, emodin, rhubarb, rhubarb phenol and emodin methy in Sheshang capsules.

HPLC; Sheshang capsules; anthraquinones; quantitative determination

R284.1

A

1674-8085（2021）05-0098-05

2021-02-16；

2021-05-19

福建省科技厅科技引导性项目(2017Y0047)

10.3669/j.issn.1674-8085.2021.05.019

*张 华(1985-)，女，福建宁德人，实验师，硕士，主要从事中药质量控制研究(E-mail: 620768665@qq.com)；

于虹敏(1984-)，女，吉林辽源人，实验师，硕士，主要从事中药质量控制研究（E-mail:640329132@qq.com)；

严国鸿(1971-)，男，福建莆田人，主任药师，硕士生导师，主要从事医院制剂及临床药学研究(E-mail: 13799327517@163.com)；

孙承韬(1992-)，男，福建漳州人，硕士，主要从事中药药效物质基础研究 (E-mail:363937598@qq.com).