基于纳米银-二氧化钛-壳聚糖复合物修饰电极的穿心莲内酯电化学传感器及其应用研究

林 露，孙照霞，王静楠，姚靖雯，余丽双

基于纳米银-二氧化钛-壳聚糖复合物修饰电极的穿心莲内酯电化学传感器及其应用研究

林 露，孙照霞，王静楠，姚靖雯，*余丽双

（福建中医药大学药学院，福建，福州 350122）

利用纳米银-二氧化钛-壳聚糖（Ag-TiO2-CS）复合物构建灵敏的穿心莲内酯电化学传感器。CV实验表明纳米Ag-TiO2-CS复合物具有良好的电化学活性，可以作为穿心莲内酯传感器的氧化还原探针，当加入穿心莲内酯后，修饰电极的峰电流值变小，且随着穿心莲内酯浓度的增加而逐渐减小。DPV实验表明，修饰电极峰电流值与穿心莲内酯浓度对数值在一定范围内呈线性关系，方法学考察结果均良好。将所建立的电化学方法应用于穿心莲内酯软胶囊制剂实际样品，实验结果理想。

穿心莲内酯；电化学传感器；Ag-TiO2-CS纳米复合物；修饰电极

穿心莲内酯是穿心莲[]的主要有效成分，穿心莲内酯主要有抗病原微生物、解热抗炎、抗生育、利胆保肝、抗肿瘤等作用[1]，对细菌性上呼吸道感染、病毒性上呼吸道感染、痢疾等也有很好的疗效[2-3]，被誉为天然的抗生素药物。临床上用于治疗各种炎症、钩端螺旋体病、增强肾上腺皮质功能等[4-5]。

目前中国药典公布的穿心莲内酯检测方法多为高效液相色谱法[6]，文献报道关于穿心莲制剂中穿心莲内酯的检测方法亦也是以液相色谱法为主[7-10]。例如赵振霞等采用双波长超高效液相色谱法测定穿心莲胶囊中穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯的含量，用于评价穿心莲内酯胶囊的质量控制及评价[8]。另外亦有关于利用薄层扫描法[11-12]、极谱法[13]和胶束电动毛细管色谱法[14-15]等方法检测穿心莲内酯的报道。例如，赵伟利用改进后薄层色谱鉴别法对复方穿心莲片进行鉴别[12]；邹洪等用单示波极谱法[13]在0.2 mol/L NH4Cl + 0.25 mol/L NH3·H2O中检测穿心莲内酯；李琦等用胶束电动毛细管色谱法[14]分离测定了穿心莲内酯，对样品进行加样回收实验得到回收率为102%。这些方法或实验条件较为苛刻，或操作步骤较繁琐，或所需仪器较昂贵且耗时。因此，建立一种简便、灵敏、快速检测穿心莲内酯及其制剂的新方法具有重要应用价值。

电化学分析方法主要通过电流、电位或是阻抗等电化学信号直接或是间接分析待测物质，具有操作简单、携带方便和成本低等优点，将各种新型纳米材料和复合纳米材料引入电化学分析平台构建纳米电化学传感器，可大大提高其检测灵敏度和选择性[16-17]。纳米电化学传感器已被广泛应用于环境、食品和药品等领域的分析检测[16-20]。我们查阅相关文献，未见利用Ag-TiO2-CS纳米复合物构建穿心莲内酯电化学传感器的报道。本实验利用Ag-TiO2-CS纳米复合物构建灵敏的穿心莲内酯电化学传感器，实验发现Ag-TiO2-CS纳米复合物具有良好电化学活性，将其作为电化学传感器探针，当加入穿心莲内酯后，修饰电极的峰电流值变小，随着穿心莲内酯浓度的增加而逐渐减小，且其峰电流差值与穿心莲内酯浓度在一定浓度范围内成线性关系，因此，该法可用于构建简单快速灵敏的穿心莲内酯电化学传感器，亦可用于穿心莲内酯胶囊的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

CHI660C型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；舒美KQ116超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；雷磁PHS-3C型精密酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；XS105电子分析天平（Mettler Toledo）； CJJ79-1磁力加热搅拌器（金坛市白塔新宝仪器厂）；HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TECNAI G2F20 场发射透射电子显微镜（美国FEI公司）。

三电极体系：Ag-TiO2-CS纳米复合物修饰电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极。

1.1.2 试剂

穿心莲内酯（201304，中国药品生物制品有限公司）；穿心莲内酯软胶囊（珠海金鸿药业股份有限公司，批号：150809）；TiO2由福建师范大学洪振生教授提供[21]；壳聚糖、硼氢化钠、硝酸银溶液、乙腈（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（上海子钦有限公司）；不同pH值不同浓度的磷酸盐缓冲液、甲醇、乙酸（国药集团化学试剂有限公司）。

实验中所用水均为二次蒸馏水，经Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）处理。

1.2 Ag-TiO2-CS纳米复合物的制备

Ag-TiO2-CS纳米复合物参照有关文献方法制取[22]。首先，取0.5 mL TiO2(5%)、1 mL AgNO3(0.05 mo/L)和0.5 mL CS(0.1%)溶液于烧杯中，接着向烧杯中逐滴滴加0.125 mL NaBH4(0.01 mo/L)溶液，直至烧杯中溶液的颜色变成咖啡色，再继续搅拌30 min。将制得的Ag-TiO2-CS纳米复合物进行离心、洗涤，即得。

1.3 Ag-TiO2-CS修饰电极的制备

金电极在修饰前，先后用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉末在专业抛光布上抛光成镜面，每次打磨后用蒸馏水清洗干净。将处理好的电极置于含5 mM K3Fe(CN)6的0.5 M KCl溶液中，采用三电极系统在扫描电压-1 V～+0.8 V用CV法进行扫描，根据氧化还原峰电位差判断电极抛光程度，若符合要求则进行活化。活化用0.5 mol/L的稀硫酸溶液，在扫描电压0 V～+1.7 V用CV进行扫描，直到峰电流不再增加。

取制得的Ag-TiO2-CS超声分散于2 mL的蒸馏水中，得到均匀的咖啡色悬浮液。取10 μL滴涂于预处理好的金电极表面，室温下自然晾干即制得Ag-TiO2-CS修饰金电极。

1.4 穿心莲内酯对照品溶液的制备

精密称取穿心莲内酯对照品适量，用乙腈溶解并制成浓度为1.0 mg/mL的对照品储备液，检测时用支持电解质稀释到一定的浓度。

1.5 穿心莲内酯软胶囊药品处理

取装量差异下的穿心莲内酯软胶囊内容物约0.1 g，精密称定，置于25 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，超声30 min，摇匀后的上清液用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液，检测时用支持电解质稀释到一定浓度。

1.6 电化学方法

本实验以 pH值为6.5的0.1 M磷酸氢二钠-0.1 M磷酸二氢钠磷酸盐缓冲溶液为支持电解质，采用三电极系统，用差分脉冲伏安法对穿心莲内酯在修饰电极上的电化学行为进行研究并对其进行定量测定。

2 结果与讨论

2.1 Ag-TiO2-CS纳米复合物的表征

Ag-TiO2-CS纳米复合物透射电镜（TEM）表征结果如图1所示，所用二氧化钛为准八面体构型，从TEM图可以看出，Ag+成功地较均匀复合到TiO2纳米材料表面。

图1 Ag-TiO2-CS纳米复合物透射电镜图

2.2 电极的电化学特性

本实验分别用裸金电极和Ag-TiO2-CS修饰金电极作为工作电极，在不同缓冲体系下，于-0.5V～+0.6 V电位范围内进行CV扫描。图2中曲线a是Ag-TiO2-CS修饰金电极在0.1 M PBS（pH = 6.5）缓冲溶液中的CV图，曲线b和c分别是Ag-TiO2-CS修饰金电极和裸金电极在含10 μg/mL的穿心莲内酯的0.1 M PBS（pH=6.5）缓冲溶液中的CV图。从图2可以看出，穿心莲内酯在裸金电极上没有出现氧化还原峰（曲线c）；Ag-TiO2-CS修饰金电极在空白溶液中出现一对很好的氧化还原峰（曲线a），说明Ag-TiO2-CS具有很好的电化学活性，其活性来自零价Ag和一价Ag之间发生的反应；当加入穿心莲内酯对照品后，修饰电极的电流响应变低（曲线b），这可能是由于穿心莲内酯有吸附作用，但由于在该缓冲体系下，穿心莲内酯无电化学活性，其吸附于电极上阻碍了电子之间的传递从而使得峰电流值明显变小。实验发现，修饰电极的峰电流随着穿心莲内酯浓度的增大而逐渐减小，且峰电流差值（与修饰金电极在空白溶液中的峰电流对比）与穿心莲内酯浓度在一定范围内呈线性关系，因此可实现穿心莲内酯的测定。另外多次循环伏安实验发现修饰电极的还原峰峰电流值更加稳定，峰型更加理想，故而选择还原峰峰电流值进行穿心莲内酯的定量测定。

（a）修饰金电极，0.1 M PBS；（b）修饰金电极，0.1 M PBS+10 μg/mL穿心莲内酯；（c）裸金电极，0.1 M PBS+10 μg/mL穿心莲内酯

2.3 实验条件的优化

2.3.1 电极修饰液用量的优化

对电极修饰液的用量进行了优化选择，测定了不同用量对穿心莲内酯测定的影响。实验结果表明，峰电流值开始随修饰液用量增多而增大，当修饰液用量为10 μL时峰电流值最大，但当修饰液超过10 μL时，峰电流值反而减小，因此选择的最优修饰用量为10 μL。

2.3.2 缓冲溶液pH的选择

实验考察了穿心莲内酯在0.1 M PBS的不同pH缓冲溶液中的CV行为。结果表明，峰电流值与pH值有很大的关系，当pH为6.5时，峰电流值最大，大于或是小于6.5，峰电流值均变小，因而选定的最佳酸度为6.5。

2.3.3 仪器参数的优化

DPV的仪器参数影响测试的灵敏度和分辨率，实验考察了扫描速率对穿心莲内酯电化学测定的影响，基于综合考虑峰值、峰型等多种因素，实验选择了最优的扫描速率为50 mV/s。

2.4 方法学验证

2.4.1 电极重现性

平行制备6根修饰金电极，测定同一份浓度为0.25 μg/mL的穿心莲内酯对照品溶液，得到的平均峰电流为11.56 μA， RSD为3.9%。说明修饰膜可以稳定并且均匀的存在于电极表面，电极重现性良好。

2.4.2 电极稳定性

制备好的Ag-TiO2-CS修饰电极冰箱中4℃分别放置一天、一周后，分别对浓度为0.25 μg/mL的穿心莲内酯溶液进行测定，放置一天后测得的浓度为最初的99.40%，放置一周后测得的浓度为最初的93.13%，表明电极的稳定性良好。

2.4.3 工作曲线与检测限

在上述最佳实验条件下进行穿心莲内酯工作曲线测定，最后得到工作曲线：Ip(μA) = 9.6256-0.887lnc ( μg/mL )，相关系数r为0.9973，检测限为0.01 μg/mL，定量限为0.01 μg/mL。实验结果表明，穿心莲内酯浓度为0.01 ～10 μg/mL范围内时，还原峰电流差值（与修饰金电极在空白溶液中峰电流对比）与其浓度呈良好的线性关系。

2.4.4 仪器精密度

按“1.4”项下方法制备含0.45 μg/mL的穿心莲内酯对照品溶液，在最优化实验条件下重复测定6次，所测得的平均浓度为0.458 μg/mL，RSD为1.1%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.5 方法重复性

取穿心莲内酯软胶囊药材（批号：150809），按“1.5”项下方法平行制备供试品溶液6份进行分析，求得平均浓度为0.2429 μg/mL，RSD为3.4%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4.6 干扰实验

本实验考察了穿心莲内酯软胶囊中常见的稀释剂聚乙二醇、植物油，抗氧剂乙二胺四乙酸，助悬剂甲壳糖，防腐剂山梨酸甲酯、苯甲酸等对穿心莲内酯测定的影响，实验发现，软胶囊中常用的辅料对穿心莲内酯的测定均无干扰。

2.4.7 加样回收率

为了研究Ag-TiO2-CS修饰金电极对穿心莲内酯实际样品的影响，对处理好的软胶囊样品进行了加样回收率的测定。实验平行制作6份供试品溶液，并加入一定量的对照品进行加样回收率的测定，测得回收率的平均值是92.97%，RSD为4.70%（n=6），测定结果如表1所示。

表1 加样回收率测定结果

Table 1 The results of spiked sample recovery rate

标号原有量(mg )加入量(mg )测得量(mg )回收率（%）平均回收率（%）RSD（%，n=6） 10.59670.40470.97997.7792.974.7 20.53330.39050.80787.36 30.45540.39050.76990.91 40.58100.40470.93795.06 50.60070.40470.97997.37 60.61100.39050.89589.37

2.5 实际样品测定

为了检验Ag-TiO2-CS修饰金电极是否可以用于穿心莲内酯软胶囊中穿心莲内酯的含量测定，在最优化的实验条件下，平行制备了6份供试品溶液进行检测，实验测得其平均含量为标示量的94.35%，相当于含穿心莲内酯47.18 mg/粒，RSD为3.0%（n=6），测定结果如表2所示。

表2 穿心莲内酯软胶囊中穿心莲内酯的含量测定结果

Table 2 The results of the content of andrographolide in andrographolide soft capsule preparation

标号峰电流值（μ A）测得浓度（μg/mL）理论浓度（μg/mL）测得含量（标示量的%）平均含量（标示量的%）RSD（%，n=6） 19.5011.1511.19396.4694.353.0 29.6390.9851.06792.36 39.7400.8790.91196.52 49.5781.0551.16290.80 59.5321.1111.20192.48 69.4711.1911.22297.46

3 小结

本实验将Ag-TiO2-CS纳米复合物采用滴涂法修饰于金电极表面，构建Ag-TiO2-CS修饰电极，将其应用于构建穿心莲内酯电化学传感器，并成功应用于穿心莲内酯软胶囊制剂中穿心莲内酯的测定，得到加标回收率为87.36% ～97.77%，说明本方法准确、可行。所构建的修饰电极制作简单、重复性好，所构建的穿心莲内酯电化学检测新方法具有快速、灵敏、经济实用等特点，可实现穿心莲内酯制剂中穿心莲内酯的快速检测。

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Construction and Application of Andrographolide Electrochemical Sensor Based on Nano-silver-TiO2-Chitosan Complex Modified Electrode

LIN Lu, SUN Zhao-xia, WANG Jing-nan，YAO Jing-wen，*YU Li-shuang

（College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China）

In this paper, the sensitive andrographolide electrochemical sensor was constructed by using nano-silver-titania-chitosan (Ag-TiO2-CS) complex. The CV experiment showed that the nano-Ag-TiO2-CS complex had good electrochemical activity and could be used as the redox probe of the andrographolide sensor. When andrographolide was added, the peak current value of the modified electrode became smaller and gradually decreased as the concentration of andrographolide increased. The DPV experiment showed that the peak current value of the modified electrode was linear with the logarithm of the concentration of andrographolide in a certain range. Methodological study results were all good. The electrochemical method was applied to the real sample, andrographolide soft capsule preparation, and the result was satisfactory.

andrographolide; electrochemical sensor; Ag-TiO2-CS nanocomposite; modified electrode

R917

A

10.3669/j.issn.1674-8085.2021.05.004

1674-8085（2021）05-0014-05

2021-02-09；

2021-05-06

国家自然科学基金项目(82074005)；福建省科技厅计划项目(2018J01871)

林 露(1994-)，男，福建福州人，硕士生，主要从事药物分析方法学研究(E-mail:1095328548@qq.com)；

孙照霞(1990-)，女，山东烟台人，硕士，主要从事中药分析方法学研究(E-mail:1570355182@qq.com)；

王静楠(1997-)，女，福建莆田人，硕士生，主要从事现代药物分离分析新方法研究(E-mail:843014798@qq.com)；

姚靖雯(1998-)，女，福建漳州人，硕士生，主要从事药物分析方法学研究(E-mail：654229463@qq.com)；

*余丽双(1982-)，女，福建莆田人，研究员，博士，硕士生导师，主要从事中药分析方法学研究(E-mail：sly2018@126.com).