液氮冷冻联合光动力疗法治疗男性包皮尖锐湿疣的疗效观察及HPV检测分析

吴美乐，吕新翔，于希军，李东霞，马元龙，贺 伟

（内蒙古医科大学附属医院皮肤性病科，内蒙古 呼和浩特 010050）

基于5-氨基酮戊酸的光动力疗法（photodynamic therapy with 5-aminolaevulinic acid,ALA-PDT）是一种利用光化学反应进行疾病诊断和治疗的新技术，其主要的原理是增生活跃的细胞可以大量吸收光敏剂ALA，而正常细胞吸收得很少，在特定光源激发下，导致特定细胞凋亡，进而起到靶向治疗作用[1]。无论是最早的病例报道还是病例对照研究的文献，均报告ALA-PDT在尖锐湿疣的治疗有效性、降低复发率方面均有显著的优势，并且在清除HPV感染方面也具有突出的效果[2]。为进一步探讨光动力治疗男性包皮尖锐湿疣的效果及可能的治疗机理，选取80例未经治疗的男性包皮尖锐湿疣患者，观察尖锐湿疣的治疗效果和复发情况，并在治疗前后对患者皮损区域进行HPV基因检测（HPV6或HPV11），分析其对HPV感染清除的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018年1月～2019年6月就诊于本院皮肤性病科门诊的男性尖锐湿疣患者作为研究对象（皮损位于包皮部位），经临床、醋酸白试验或组织病理确诊，并且HPV基因检测阳性（HPV6或HPV11阳性）。对所有患者在治疗前结合病史及检查化验进行筛查，排除标准：① 合并其他传染性疾病（包括其他性传播疾病）；② 合并免疫功能低下的其他疾病（如HIV感染、糖尿病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、系统使用糖皮质激素或免疫抑制剂、接受放疗或化疗等）。共有80例符合纳入标准的患者，对其进行治疗观察。将所有患者随机分为两组，即治疗组和对照组，每组各40例。患者年龄（19～65）岁，平均（36.5±12.8）岁。所有患者的皮损直径＜1cm，皮损数目（3～20）个。治疗组先给予冷冻治疗一次，次日开始光动力治疗，每周1次，连续治疗4次。对照组仅选择冷冻治疗，每周1次，连续治疗（3～4）次（根据皮损清除情况决定治疗次数）。本研究经过内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准（NO.YJ2019073），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 治疗方法 光动力治疗方法：0.1%新洁尔灭溶液常规消毒皮损区域皮肤后，将用5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，上海复旦张江生物医药股份有限公司）配制成的20%的凝胶，立即均匀涂于疣体及其周边1cm范围外观正常的皮肤黏膜上。涂药剂量按照38mg/cm2计算，即直径2cm（3.14cm2）皮肤范围应用118mg ALA药物，保鲜膜封包，避光3h。封包结束后，用输出波长635nm，能量密度（100～120）J/cm2的LD600-A型半导体激光治疗机照射（上海复旦张江生物医药有限公司提供），每个光斑照射20min。

冷冻治疗：常规使用0.1%新洁尔灭溶液消毒皮损区域后，用医用棉签蘸取液氮点涂于疣体处，根据疣体大小进行（2～3）个冻融周期。

1.3 复发情况评估及HPV基因检测实验方法 所有患者随访至第8周末进行疗效评估，利用醋酸白试验观察疣体复发情况。皮损区域在治疗前（基线）和治疗后第8周末分别进行HPV基因检测（HPV6/11）。取材方法：利用无菌取材刷反复刷疣体表面（3～5）次，以取得脱落的角质表皮细胞。治疗8周后，利用同样方法在疣体或原疣体部位进行取材。HPV基因检测采用商业化的HPV基因分型试剂盒进行检测（亚能生物技术（深圳）有限公司，深圳），具体实验步骤按照试剂盒说明进行操作，依次进行HPV-DNA提取、PCR扩增、杂交及结果判断。

1.4 统计学方法 所有数据利用SPSS 13.0软件进行统计分析，计数资料用（%）表示，Fisher's确切概率法检验比较两组间的差异。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

随访至第8周末评估结果显示 治疗组40例患者中有35例未见新发疣体（87.5%），未见疣体复发，5例有新疣体复发（12.5%）；对照组40例患者中有22例未见新发疣体（55%），未见疣体复发，18例有新疣体复发（45%）。经统计分析，差异有统计学意义（P＜0.05），患者治疗前后复发率比较见表1。

表1 两组包皮尖锐湿疣复发率及HPV清除率比较（n，%）

4周后疗程结束，随访至治疗后第8周末，对57例无疣体复发的病例（治疗组35例、对照组22例）进行了再次HPV基因检测。检测结果显示：治疗组中有17例未检测到HPV6/11（占比48.57%），对照组中有4例未检测到HPV6/11（占比18.18%）。经统计分析差异有统计学意义（P＜0.05），治疗组和对照组HPV清除率比较见表1。

3 讨论

尖锐湿疣是一种常见的性传播疾病，是由人类乳头瘤病毒（HPV）感染皮肤黏膜导致的疾病，常由HPV6和HPV11型感染导致[1、3]，临床表现以皮肤黏膜疣状增生为特征。除了肉眼可见的疣体，尖锐湿疣患者的皮损周围往往存在亚临床感染和潜伏感染。亚临床感染是指皮肤黏膜已经感染HPV，组织发生了病理学变化，但尚未出现肉眼可见的疣体。通过3%～5%冰醋酸外涂（醋酸白试验）、皮肤镜检查或皮肤病理检查可以发现亚临床感染，通过分子生物学技术方法检测HPV。文献报道正常男性生殖器HPV检测阳性率在1.3%～72.9%不等，可见HPV的潜伏感染率很高，而且会长期存在。许多患者同时感染多种类型的HPV，包括高危型HPV，因此HPV潜伏感染和亚临床感染需要更多的关注和治疗。有学者利用ALA-PDT治疗HPV亚临床感染和潜伏感染的结果显示，接受3次ALA-PDT治疗后的患者的HPV病毒清除率显著高于接受1次治疗的患者。

同时有研究表明，尖锐湿疣患者的整体免疫功能低下（受合并糖尿病、结缔组织病、恶性肿瘤、使用糖皮质激素、免疫制剂等因素影响），细胞免疫功能低下亦是引起复发的重要因素。也有可能皮损局部存在免疫功能低下，导致皮损迁延不愈、反复复发，这也为多种方法治疗尖锐湿疣提供了科学依据。目前，可用于治疗尖锐湿疣方法众多，包括物理治疗（如液氮冷冻、CO2激光、手术等）、光动力治疗、外用药物治疗（如5%咪喹莫特乳膏、0.5%鬼臼毒素酊、5% 5-氟尿嘧啶乳膏等）、抗病毒治疗、提高免疫功能（如干扰素、转移因子或胸腺肽等）等。对于尖锐湿疣治疗方法的选择需要对皮损数量、大小形态、位置、疣体角化程度、病程（初发或复发）以及合并疾病等因素进行综合考虑。冷冻治疗的优势在于可以快速祛除肉眼可见的疣体，并且简单易行，被临床广泛应用，其缺点是皮损复发率高，以及冷冻治疗后局部出现水疱、糜烂、疼痛、色素沉着、色素脱失等。

近年来，光动力疗法（ALA-PDT）被广泛应用于皮肤肿瘤、皮肤癌前病变、痤疮和尖锐湿疣等疾病的治疗中，并取得良好的效果。ALA-PDT的作用机理是异常增生的组织吸收光敏剂后，经特定波长（红光）和能量的光照射后［能量密度（100～150）J/cm2］，光敏剂受到激发发生光动力敏化反应，产生活性氧物质，进而选择性地破坏病变组织。另外，ALAPDT可以直接作用于HPV，抑制病毒复制，进而清除HPV。还有研究表明，ALA-PDT可以改善患者全身和局部的免疫功能，提高机体抗HPV能力。此外，由于ALA-PDT可以诱导癌变或潜在的癌变细胞凋亡，ALA-PDT被证明是治疗皮肤肿瘤、癌前病变有效的方法。本研究先采用冷冻治疗祛除肉眼可见的疣体后，再联合光动力疗法，联合治疗组在治疗结束后（第8周）肉眼可见疣体的复发率（12.50%）明显低于单纯冷冻治疗组（45.00%）。而联合治疗组HPV清除率（48.57%）明显高于单纯冷冻治疗组（18.18%）。由此可见，光动力疗法可有效清除HPV或减少亚临床感染和潜伏感染。光动力治疗之所以能有效降低尖锐湿疣的复发率，是因为其包括抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡、对增生血管的直接损伤作用、诱发机体局部或（和）全身的免疫反应、抑制病毒复制等机制。王焕丽等利用光动力疗法治疗复发性尖锐湿疣患者的HPV转阴率为42.5%，明显高于对照组的17.5%，对HPV仍阳性的患者，HPV病毒载量下降程度也大于对照组。Owczarek W等的研究发现光动力疗法对整体HPV的清除率可以达到66.67%，而对于低危型的HPV6/11，病毒清除率可以达到76.92%。有研究发现PDT治疗6个月后HPV阴转率为66.7%。一项荟萃分析显示ALA-PDT治疗后尖锐湿疣患者的疣体清除率可以达到96%，显著高于激光（69%）或外用药物（14%）治疗的患者，复发率仅为7.5%，也显著低于利用激光（24%）和外用药物（31%）治疗的患者。这些研究结果与本研究的结果相一致，都提示ALA-PDT可以提高疣体和HPV的清除率，减少复发。冷冻治疗可以快速去除肉眼可见疣体；此外，冷冻还导致皮肤黏膜的损伤，也增加了ALA的吸收，两种治疗方法结合起来，扬长避短，优势互补，疗效显著。既往的HPV亚临床和潜伏感染的治疗研究结果均显示，有效的ALA-PDT（3次以上）可以有效清除HPV感染或减低病毒载量。但需要注意ALA-PDT治疗局部刺激反应发生率较高，文献报道其不良反应的发生率（69%）高于激光治疗（28%）或外用药物治疗（30%）的患者。ALA-PDT治疗后不良反应与ALA药物的配置浓度和治疗次数有着明显的关系。因此ALA-PDT治疗需要按照规范流程进行操作。文献报道最佳治疗次数为（3～5）次，ALA配置浓度以20%最为适宜，浓度太低治疗效果差，浓度太高则局部不良反应增加。也有研究发现，高危型HPV感染尖锐湿疣患者如果要达到病毒学痊愈，ALA-PDT治疗次数要高于低危型患者，因此，对于尖锐湿疣患者进行HPV亚型检测对指导临床治疗具有重要的意义。

HPV和宿主之间的相互作用是一个漫长而又复杂的生物免疫过程，如仅使用传统物理疗法（如冷冻治疗）去除疣体，HPV亚临床感染和潜伏感染仍然存在，易导致尖锐湿疣复发，而且具有传染性，可以通过性接触或间接接触传染给性伴或家人。孕妇在分娩过程中，也可通过产道导致胎儿感染HPV。部分高危型HPV的持续感染与肛门生殖器癌的发生密切相关。因此，尖锐湿疣的治疗目标应达到真正的生物学治愈，完全消除HPV对人体组织的有害影响。体外细胞学研究显示，ALA-PDT治疗后可以通过Ca2+-CamKKβ-AMPK通路导致Hela细胞（HPV18感染）的自噬，可能是其治疗HPV感染的机制之一。并且，ALA-PDT治疗后的HeLa细胞后，LC3II和p62呈现高表达，半胱天冬酶-3（caspase-3）和裂解半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）表达上调，提示通过ALA-PDT治疗可能通过Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路来诱导细胞自噬和细胞凋亡，进而降低HPV病毒载量。

综上所述，液氮冷冻联合光动力疗法可以显著减少尖锐湿疣患者的HPV亚临床感染和潜伏感染，提高HPV清除率。在选择尖锐湿疣治疗方法时，如果先选择物理方法去除疣体（如冷冻治疗），然后再进行光动力治疗，可以更好地清除亚临床感染和潜伏感染的HPV，进而减少尖锐湿疣的复发，但其确切机制仍需要进行更加深入的研究。