低温异养硝化菌的筛选、鉴定及降解特性研究

李珍阳 姜润 刘琳 李思琦 王晓慧

（1. 陕西省西咸新区空港新城管理委员会，西安 712034；2. 北京化工大学化学工程学院，北京 100029）

随着我国人口数量的增加，工农业的快速发展，氨氮污染问题日益突出［1］。氨氮主要来源于生活污水、农业灌溉及工业废水［2］。氨氮含量过高不仅会造成水体富营养化，也会对人体健康构成威胁。目前，在氨氮的处理技术中，生物法具有设备简单、成本低、效率高等优势，已成为氨氮去除的主流技术［3］，如连续流分段进水生物脱氮工艺（continuous step feed biological nutrient removal，CSFBNR）［4］，新型预曝气/厌氧-缺氧-好氧法（anaerobic-anoxicoxic，OAA）/间歇曝气的组合工艺（sequencing batch reactor，SBR）［5］等。生物法去除氨氮主要是利用硝化菌来完成，在好氧条件下，硝化菌会将NH4+-N或有机氮降解转化为亚硝酸盐氮和硝酸盐氮，进而在通过反硝化细菌完成脱氮。硝化细菌分为异养型和自养型，与对环境因素敏感的自养型硝化菌相比，异养型硝化菌具有适应性强，能以多种有机物作为碳源进行生长繁殖等优势而被广泛应用［6-9］。近年来，发现越来越多的异养型硝化菌，Gupta等［10］发现菌株 T. pantotropha 制成的混合菌剂具有较好的硝化能力，Joo、Rout和Zhang等［11-13］也发现了3种不同菌属的异养硝化菌，分别为产碱菌属（Alcaligenes）的Alcaligenes faecalis strain 4、芽孢杆菌属（Bacillus）的Bacillus cereus GS-5 strain、假单胞菌属（Pseudomonas）的 Pseudomonas stutzeri YZN-001。

然而生物法去除氨氮仍存在较大弊端，在北方地区尤其是黑龙江省，冬季水温处于10℃以下，异氧硝化菌的生物活性受到抑制［14］，出水中氨氮含量过高，最终会导致出水质量不佳。经调查研究发现，目前低温菌的筛选存在以下问题：（1）筛选温度过高，冬季不适用，如赵燕［15］从青藏高原冻土中筛选出3株脱氮优势菌株，并按一定比例将3株脱氮菌配制成混合菌群投加至氨氮废水中，在16℃的条件下，配制得混合菌群对NH4+-N的去除效率达85%；（2）低温筛选的菌株氨氮的去除效果不佳，如孙静等［16］从北方人工湿地分离筛选得到一株菌可8℃条件下进行脱氮，氨氮去除率为50.63%。因此筛选出低温高效的异养硝化菌是解决此类问题的关键。本研究分别从3种不同的泥样中，在13℃条件下筛选出3株耐低温性能较好的异养硝化菌，并对分离出的菌株进行形态特征、生理生化特性以及16S rDNA测序结果进行分析。根据前人研究所设温度和处理效率的高低［15-16］，选择更加贴近冬季且处理效率较高的温度，因此培养温度设置为13℃。选用3种不同的污泥制成复合菌剂，因为复合菌剂可能存在协同菌株，可以提高氨氮去除效率，同时进行固定化后可避免菌的流失，因此将筛选的菌株按一定比例进行混合后形成复合菌剂，分析碳源种类、氮源浓度、pH及盐度等条件对菌剂硝化性能影响，进而确定最优硝化条件，最后对复合菌剂进行固定化测定氨氮去除效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 泥样样品来源 泥样分别取自实验室培养的好氧颗粒污泥、冬季北京化工大学污水处理站活性污泥、江苏省某污水处理厂生物转盘污泥。

1.1.2 培养基的种类及成分配比 根据培养需要，共配置4种类型的培养基，分别为活化培养基、富集培养基、异养硝化液体培养基和异养硝化固体培养基，培养基的pH范围7.0-7.4，成分配比如表1所示，培养基的配置参考袁雪娇［17］培养高效异养硝化菌的配方。配置好的培养基均置于高压灭菌锅中121℃，灭菌30 min后再使用。

表1 培养基成分表Table 1 Medium composition

1.1.3 试剂的配制 1 mol/L的NaOH溶液：称取4 g的NaOH固体粉末于烧杯中，加入适量的蒸馏水使之溶解，再用100 mL的容量瓶定容。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、分离、纯化及保存 富集：将冬季北京化工大学污水处理站的活性污泥进行静置沉淀，取10 mL沉淀后的活性污泥样品，5 g生物转盘泥样、5 g实验室培养的好氧颗粒污泥，分别置于含无菌水的锥形瓶中进行振荡培养。锥形瓶中加入少量玻璃珠，将污泥絮体打散，有利于菌的释放。振荡一段时间后静置10 min，取10 mL的上清液于富集培养基中进行异养硝化菌的富集，置于13℃、150 r/min恒温培养振荡器上培养，直至培养基浑浊。然后再取10 mL富集培养液于新的富集培养基中进行培养，此步骤重复4次，以确保得到较高的菌浓度。

分离：取1 mL最终富集培养液于9 mL的无菌水中进行梯度稀释，稀释梯度为10-1-10-6。选择10-4、10-5和10-6的稀释浓度，各取200 μL菌液采用稀释涂布法涂布于固体培养基倒置培养，每份样品做3个重复，最后置于生化培养箱中进行培养，温度为13℃。

纯化：待培养基长出菌落后，挑取单个菌落，通过平板划线法反复划线得到纯化的菌落。

保存：将纯化的菌株接种于斜面培养基上，放入培养箱中直至斜面长出菌落后放于4℃冰箱保存，每两个月进行菌株的活化，活化后在进行培养接种于斜面。同时将菌株进行扩大培养与已灭菌40%的甘油以1∶1的比例存于-20℃冰箱。

1.2.2 菌株筛选 将上述分离得到的纯化菌株进行扩大培养，吸取适量培养后的菌液置于离心机上5 000 r/min，离心3 min，然后制备成菌悬液放入含异养硝化液体培养基的锥形瓶中，在好氧的条件下，在13℃、150 r/min的条件下振荡培养5 d。测量培养前后菌液中NH4+-N的含量变化，筛选出能够在低温条件下，较好降解NH4+-N的菌株。重复上述操作，以筛选出高效降解NH4+-N的菌株。将筛选出的菌株进行鉴定，包括形态观察、革兰氏染色及16S rDNA测序分析。

16S rDNA测序分析步骤：用DNA试剂盒提取DNA，选取引物27F primer和1492R，序列分别 为AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和TACGGYTACCTTGTTACGACTT。PCR反应体系如表2所示。PCR反应过程：预变性94℃ 3 min，进行1次循环；变性 94℃ 30 s；退火 54℃ 30 s；延伸 72℃ 90 s。变性、退火和延伸过程循环24次。

表2 PCR反应体系Table 2 PCR reaction system

绘制生长曲线时，需将斜面培养基上经过筛选的菌株活化，并置于恒温振荡培养箱中进行培养，每隔3 d测定一次OD600。

1.2.3 复合菌株的构建 设计3因素3水平正交实验，3因素分别为上述筛选出的高效降解菌株命名为AJ-5、BJ-4和CJ-1，3水平分别为接种量1 mL、2 mL和3 mL。将AJ-5、BJ-4和CJ-1活化获得菌悬液，各菌液调至OD600相同，按正交实验的各菌株接种量进行混合，然后接种于含100 mL异养硝化液体培养基的锥形瓶中13℃，150 r/min培养3 d，测量培养前后菌液中NH4+-N的含量变化，确定最佳配比。

1.2.4 菌株脱氮因素影响 碳源种类、氮源浓度、pH和盐度对异养硝化菌的脱氮性能具有显著的影响［18-23］。本实验通过选取4种碳源（乙酸钠（CH3COONa）、葡萄糖、柠檬酸钠、丁二酸钠），按照C/N=15计算添加量［24］，5个氮源浓度梯度（50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L 和 400 mg/L），5个pH值（pH为5、6、7、8和9）和4个盐浓度梯度（10 g/L、20g/L、30 g/L和40 g/L）来探究不同因素对复合菌剂去除NH4+-N能力的影响。

1.2.5 复合菌的固定化及脱氮效率 采用海藻酸钠-硅藻土对复配菌株进行包埋固定化，其成分比例为硅藻土1%、海藻酸钠（sodium alginate，SA）2%、CaCl23%和沸石6%，从污水处理站的曝气池采集生活污水，NH4+-N 浓度为3.92 mg/L，每升污水中添加NH4Cl 0.04 g，得到NH4+-N含量为15.13 mg/L，进行3组实验，1组作为空白对照组，2组为游离复合菌剂组，3组为固定化颗粒组，测定其处理效果。

1.2.6 测定方法 NH4+-N测定采用纳氏试剂分光光度法；OD600测定采用光电比浊法；pH值用FE28 pH计进行测量。

2 结果

2.1 菌株筛选结果

从活性污泥中筛选出低温异养硝化菌19株，生物转盘中筛选出17株，好氧颗粒污泥中筛选出14株，根据图1显示上述部分菌株降解NH4+-N情况，选出降解效率最好的3株菌分别命名为AJ-5、BJ-4和CJ-1，其对应的NH4+-N去除率为70.57%、73.66%和68.14%。

图1 菌株对NH4+-N的去除率Fig. 1 Removal rate of NH4+-N by various strains

2.2 菌落的形态特征

菌株AJ-5在固体培养基上呈乳白色，不透明，表面湿润易被挑起，革兰氏染色呈阴性（图2-A，图3-A）；菌株BJ-4的菌落形态呈乳白色，不透明，表面湿润凸起，边缘整齐，革兰氏染色呈阴性（图2-B，图3-B）；CJ-1的菌落同样为乳白色，不透明，表面湿润，但是边缘不整齐，革兰氏染色呈阴性（图2-C，图 3-C）。

图2 各菌株菌落形态Fig.2 Colony morphology of each strain

图3 革兰氏染色呈像Fig.3 Gram chromatogram of each strain

2.3 16S rDNA序列及系统发育分析

对16S rDNA测序结果分析可知，AJ-5的序列长度为1 316 bp，BJ-4的序列长度为1 310 bp，CJ-1的序列长度为1 327 bp。将测序结果与EzBioCloud数据库进行对比，结果显示AJ-5鉴定为Acinetobacter johnsonii strain，BJ-4鉴定为Acinetobacter celticus strain，CJ-1鉴定为Acinetobacter albensis strain，3株菌均为不动杆菌属。选择Mega.7.0的NJ（neighbour Joining）法构建各菌株的系统发育树，其结果如图4-6所示。

图4 菌株AJ-5的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of the bacterial strain AJ-5

2.4 菌株的生长曲线

AJ-5、BJ-4和CJ-1的OD600的变化情况如图7所示。从图中可知，0-15 h内，3株菌处于适应阶段，生长不明显。15 h-27 h内，各菌株处于对数生长期，营养物质充足，生长迅速。27 h，CJ-1的OD600最大的浓度值为0.766，27 h-39 h内，该株菌处于稳定期，OD600变化不明显，39 h后开始有较为明显的下降趋势，此时菌的数量减少。AJ-5和BJ-4的OD600的浓度值在30 h左右达到最大，分别为1.379和0.738，之后AJ-5的OD600的浓度值一直维持在1.3左右的水平，而BJ-4则随时间增加而减少，BJ-4、CJ-1后期数量开始下降可能是对碳源的利用能力较低，营养物质短缺导致，因此AJ-5适应低温的环境能力更强，能够更高效的利用能源物质。综上所述，为保证充足的生物量，应选择30 h左右的菌液。

图5 菌株BJ-4的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of the bacterial strain BJ-4

图6 菌株CJ-1的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of the bacterial strain CJ-1

图7 菌株生长曲线图Fig.7 Growth curve of strain

2.5 复合菌株最佳配比确定

如上所述，选择30 h左右的菌液进行正交实验，来确定最佳配比，其结果如表3所示。根据K值高低可判断，最佳为A1B1C1即AJ-5、BJ-4和CJ-1各1 mL进行混合，氨氮的去除能力可达72.94%，同时将复合菌剂命名为ABCJ-1。对比各因素的极差R，C因素的R最高为4.15%，说明CJ-1接种量对氨氮去除率影响最大，原因可能是CJ-1的接种量大小会引发更为激烈的营养物质竞争，3株菌株的生物量发生改变，从而影响氨氮的去除率。因此适宜的接种量对于复合菌剂的硝化能力也具有重要的意义。

表3 正交实验设计及结果Table 3 Design and results of orthogonal experiment

2.6 菌株脱氮因素研究结果

2.6.1 碳源种类对复合菌株（ABCJ-1）脱氮效果的影响 本次共选取4种常见的有机碳源进行探究，分别是乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠和葡萄糖。不同碳源对氨氮去除率的影响以及OD600的变化情况如图8所示。从图8-A可知，以柠檬酸钠为唯一碳源菌剂生长最好，30 h后OD600维持在1.2左右，其次是丁二酸钠、乙酸钠，以葡萄糖为唯一碳源菌剂生长最差，几乎无增长现象。由图8-B可知，菌剂在柠檬酸钠的培养基中NH4+-N去除效率最高为84.91%，丁二酸钠、乙酸钠次之去除效率也在65%以上，在葡萄糖培养基中，无去除效果。综上所述，柠檬酸钠为最佳碳源。同时可以观察到添加不同碳源的菌剂NH4+-N去除效率与其生长量变化是一致的，说明菌株的生长量对于菌剂的硝化能力有直接影响。

图8 菌剂在不同碳源下OD600浓度变化（A）及NH4+-N去除率变化（B）Fig.8 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different carbon sources

2.6.2 氨氮浓度对复合菌株（ABCJ-1）脱氮效果的影响 氨氮浓度高低直接影响碳氮比，因此也是影响微生物生长的重要因子。由图9-A可知，NH4+-N的浓度为50 mg/L时，OD600接近1，NH4+-N的浓度为100 mg/L-400 mg/L时，OD600大于1.1，说明菌剂具有较好的耐受性，可在高氨氮浓度下正常生长。由图9-B可知，NH4+-N的浓度为50 mg/L，几乎完全去除，去除率可达96.92%，但随着NH4+-N浓度的增加，去除效果越来越差，可能是C/N过低，影响了微生物的硝化过程，抑制了硝化反应的进行。综上所述，最适的NH4+-N的浓度为50 mg/L。

图9 菌剂在不同氮源浓度下OD600浓度变化（A）及NH4+-N去除率变化（B）Fig.9 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different nitrogen source concentration

2.6.3 pH对复合菌株（ABCJ-1）脱氮效果的影响pH的高低会影响微生物的生长及生物活性，因此选取适宜的pH对菌剂硝化能力具有重要意义。由图10-A可知，在pH为5-8范围内，菌剂的生物量会随着pH的上升而增加，当pH 8时，OD600浓度值最大约为1.1，当pH大于8时，OD600浓度值小于1，说明复合菌剂更适合在弱碱性的条件下生长。菌剂在不同初始pH条件下对NH4+-N的去除效果如图10-B所示，随着pH的增加，NH4+-N的去除率从45.2%增值至82%，当pH 8时，NH4+-N的去除率最大为82%，当pH＞8时，NH4+-N的去除率有所下降，因此最佳pH为8。

2.6.4 盐度对复合菌株（ABCJ-1）脱氮效果的影响 本实验设计了盐度梯度来探究不同盐度对菌剂生长及硝化能力的影响。由图11-A可知，盐度在10 g/L-30 g/L范围内，菌剂的OD600均可达到1.1以上，但是会随着盐度增加，生长所需的时间越来越长，当浓度大于30 g/L时，菌剂的生长状态变差，OD600仅0.318。菌剂对NH4+-N的去除率如图11-B所示，10 g/L-20 g/L时，去除效果良好，可达70%以上，当浓度大于30 g/L，去除效率低于60%。综上所述，菌剂的最适宜的盐度范围为10 g/L-20 g/L。

图11 菌剂在不同盐度下OD600浓度变化（A）及NH4+-N去除率变化（B）Fig.11 Change of NH4+-N removal rate (A) and OD600 concentration (B) of microbial inoculum under different salinities

2.7 复合菌剂的脱氮效果

按照比例硅藻土1%、SA 2%、CaCl23%、沸石6%，在最优化的条件下进行固定化，1组为空白对照组未作处理，2组为游离复合菌剂，3组为固定化菌剂，菌剂对氨氮的去除效率如图12所示。随着时间增加NH4+-N含量先依次下降后有轻微上升。在48 h时，1组NH4+-N去除率为40.4%；2组NH4+-N去除率为84.28%；3组NH4+-N的含量降至0.626 mg/L，去除率为95.86%，固定化菌剂处理效果最好。

图12 固定化菌剂氨氮的去除效率Fig.12 Removal efficiency of ammonia nitrogen immobilized bacteria agent

3 讨论

对复合菌剂进行探究的过程中，我们分别从碳源种类、氨氮浓度、pH、盐度4个方面进行讨论。碳源种类不仅影响着异养硝化菌的生长繁殖，同时还影响着硝化能力的大小［25］。有些异养硝化菌如Alcaligenes faecalis No.4［26］对于碳源要求极为苛刻，从而也限制了该菌的广泛应用，便宜易得、去除效果较好的碳源对于低温异养硝化菌的实际应用很重要。ABCJ-1的最佳碳源为柠檬酸钠，其原因可能是柠檬酸钠是代谢过程中的产物，更容易被细菌利用进行代谢繁殖，且分子质量小于300，有研究表明，好氧硝化会受碳源分子质量的影响，尤其是分子质量小于300的碳源，若浓度过高会对硝化过程产生显著的抑制作用［27］。本次以C/N为15计算碳源的添加量，去除效率可达84.91%，进一步证明了Liu等［24］研究成果的可靠性，同时在较低碳氮比的条件下进行硝化反应可有效解决碳源不足等问题。

最佳NH4+-N的浓度为50 mg/L，在100 mg/L-400 mg/L浓度范围内，OD600仍维持在1.1。在城市污水处理系统中，自养型硝化菌的比例为0.086，氨氮需要保持一定浓度才能保证自养型硝化菌的正常生长［28］，而ABCJ-1耐高氨氮浓度，因此氨氮浓度冲击对菌剂生长影响较小，相比之下，复合菌剂更具有生存优势。

适宜的pH会维持微生物体内酶的稳定性，并通过影响细胞膜的电位来促进对营养物质的利用［29］。ABCJ-1的最适pH为8，但在酸性环境下，复合菌剂生长缓慢，菌剂的生长量小于0.7，其原因可能是在酸性条件下游离氨（NH3）数量较少，降低了参与硝化反应过程中氨单加氧酶（AMO）的活性，从而会抑制异养硝化反应［30］。

高盐度废水会影响菌体内脱氢酶的活性，抑制其生长和相关的生理功能［31］，但是也有研究表明，适量的盐会促进微生物的生长，如Halomonas campisalis ha3菌［32］，加入适量的NaCl后，生长速率可达到 0.58 h-1，本研究确定的最佳盐度范围为10 g/L-20 g/L，其适应盐度范围相比于HN-02菌株［33］更为广泛。

从复合菌剂的脱氮效果来看，固定化颗粒比游离的复合菌剂去除效果更好，其原因在于复合菌剂进行固定化后，生物的负荷量高，菌不易流失，生物稳定性提升，耐受力也随之增强［34］。

低温异养硝化菌对冬季污水处理厂的污水处理具有重要意义，除了探讨环境因素外还需要探究低温异养硝化菌的耐冷机制以及其他功能的发掘，以更好地应用到实际中，解决冬季生物处理的难题。马银鹏等［35］在一株低温氨氮去除能力较强的异养硝化细菌Acinetobacter harbinensis HITLi 7T的基因组信息中发现了冷休克蛋白基因SE27_RS01265，该基因在12.5℃时进行高表达，因此推测在不动杆菌中，该蛋白是菌株耐冷的主要调节因子。同时Richardson等［36］提出了异养硝化菌的脱氮途径的假说，如图13所示。该图不仅列出硝化反应涉及的酶，同时表明了反硝化途径中参与的酶，因此可通过判定酶的种类来间接验证是否存在反硝化作用。本次筛选出的低温复合菌剂可以在耐冷基因表达以及是否存在好氧反硝化作用方面进行后续深入地探究。

图13 异养硝化菌的脱氮途径Fig.13 Nitrogen removal ways of heterotrophic nitrifying bacteria

4 结论

从3种不同的泥样中共筛分出3株低温异养硝化菌，分别命名为AJ-5、BJ-4和CJ-1，通过16S rDNA的测序以及系统发育树的构建，确定3株菌均属于不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。通过正交实验，确定复合菌剂的最佳配比1∶1∶1，将复合菌剂命名为ABCJ-1，并探究碳源种类、氨氮浓度、pH及盐度对ABCJ-1脱氮的影响，结果显示当碳源为柠檬酸钠，氨氮的浓度为50 mg/L、pH 8、盐度在10 g/L-20 g/L时，ABCJ-1硝化能力最好。对复合菌剂按照比例硅藻土1%、SA 2%、CaCl23%和沸石6%进行固定化后，氨氮的转化能力可达95.86%。